Обоснование выбора и концентрации антител для включения их в состав конъюгата с наночастицами золота

В иммунодиагностике используются как моноклональные антитела, так и поликлональные. Моноклональные антитела обладают рядом преимуществ: полная стабилизация препарата антител, высокая специфичность, свободный выбор антигенных детерминант, к которым образуются антитела [54].

Наиболее важными характеристиками для выбора антител, входящих в состав конъюгата, являются: изотип, молекулярная масса, концентрация антител в буфере, вид буфера, в котором они находятся.

По данным литературы оптимальная концентрация для нанесения антител на рабочую нитроцеллюлозную мембрану в тестовую зону находится в диапазоне 0,5-3 мг×см^-3 [55]. Антивидовые антитела для формирования контрольной зоны наносят, как правило, в концентрации 1 мг×см^-3 [56, 57]. Внесение избыточного количества реагента приведет к увеличению несорбированных на поверхности молекул и к снижению аналитических характеристик производимой системы. Снижение же количества антител ниже указанного уровня в большинстве случаев недостаточно для эффективного специфического взаимодействия и формирования аналитической и контрольной зон высокой интенсивности, что снижает чувствительность иммунохроматографической системы [55].

Наилучшие результаты по чувствительности разрабатываемых тест-систем обеспечивает сукцинатно-боратный, либо трисовый буфер, однако наиболее длительное хранение антител обеспечивает фосфатный буфер. По-видимому, это объясняет, что большинство коммерческих антител выпускаются в фосфатном буфере. При приготовлении конъюгата и нанесении антител на нитроцеллюлозную мембрану для обеспечения более высокой чувствительности, по данным литературы, проводят предварительный диализ антител, находящихся в фосфатном буфере против сукцинатно-боратного, либо трисового буфера [18].

На аналитические свойства, разрабатываемой тест-системы влияет, как уже было сказано выше, изотип иммуноглобулинов. Наилучшими адсорбционными способностями для посадки на молекулу коллоидного золота и нитроцеллюлозную мембрану, а также по обеспечению специфического взаимодействия между антителами, находящимися в конъюгате с коллоидным золотом, и антителами в тестовой зоне, обеспечивают молекулы иммуноглобулинов класса G, являющиеся по своей структуре мономерами.

Проведя анализ имеющихся на рынке антител к H. pylori, с учетом ограниченных финансовых возможностей, для работы были отобраны антитела, представленные в таблице 4.

Таблица 4 – Перечень антител, используемых для получения конъюгата с наночастицами КЗ

Наименование	Изотип	Концентрация, мг×мл-1	Характеристика буфера	Производитель
Мышиные моноклональные антитела к белку CagA Helicobacter pylori. Клон HP-1811	IgG	4,5	фосфатно-солевой буфер, рН 7,4, 0,1 % азид натрия	«Биалекса», Россия
Мышиные моноклональные антитела к белку CagA Helicobacter pylori. Клон HP-387	IgG	8,0	фосфатно-солевой буфер, рН 7,4, 0,1 % азид натрия	«Биалекса», Россия
Антитела поликлональные кроличьи IgG pab Rabbit anti Helicobacter pylori	IgG	5,0	0,01 М фосфатно-солевой буфер, рН 7,2 0,1% азид натрия	НПО "БиоТест Системы", Россия (кат. № 18-511-245040)

При выборе учитывали необходимые для разработки иммунохроматографических тест-систем характеристики антител, о чем было сказано выше: достаточную для экспериментального маневра концентрацию антител, нахождение антител в растворе фосфатного буфера для обеспечения возможности увеличения периода работы с ними, отношение моноклональных антител к классу иммуноглобулинов G, возможность комбинации моноклонов в конъюгате с поликлонами в тестовой зоне. Для уменьшения риска получения отрицательного результата при разработке иммунохроматографической тест-системы для выявления возбудителя хеликобактериоза была отобрана пара моноклональных антител, получаемых фирмой «Биалекса» (Россия) и рекомендованных для разработки соответствующей иммуноферментной тест-системы.

Учитывая, что конъюгат антител с наночастицами коллоидного золота является одним из наиболее важных составляющих компонентов иммунохроматографической тест-системы, в отношении отобранной пары моноклональных антител при выполнении экспериментальной части работы целесообразно провести определение концентрации наиболее оптимальной для посадки на коллоидное золото, а также параллельно оценить адсорбционные способности полученных серий золота и выбрать наиболее перспективные варианты препарата для дальнейшего использования при приготовлении конъюгата.

С этой целью определяют «золотое число». «Золотое число» – это минимальное защитное количество гидрофильного полимера, достаточное для предотвращения коагуляции 10 мл золя золота при добавлении к нему 1 мл 10% раствора NaCl. Данный метод впервые был предложен Жигмонди. «Золотое число» является общей мерой защитного действия, поскольку эмпирически найдено, что сильное защитное действие, предотвращающее коагуляцию золя золота, обычно проявляется в такой же степени и в отношении других подобных ему золей [13].

Определение золотого числа. Для определения золотого числа, по данным литературы, используют различные по составу буферные растворы: фосфатно-солевой (ФСБ), карбонатно-бикарбонатный (КББ), сукцинатно-боратный (СББ) и др. Наиболее часто с этой целью применяют
0,005 М карбанатно-бикарбонатный буфер [18].

Оценку устойчивости золя проводят в зависимости от различных концентраций добавленного стабилизатора (биоспецифического зонда) с использованием агглютинационных титровальных планшетов с объемом лунок 250 мкл. При этом двойные разведения зонда (начальная концентрация 1 мг/мл) в количестве 20 мкл смешивают с 200 мкл золя золота с оптимальным значением рН, затем в каждую лунку добавляют 20 мкл 10% раствора NaCl.

Последняя лунка в ряду разведений конъюгата, не изменившая своего цвета после добавления солевого раствора, содержит минимальное количество полимера (антитела, антигена), необходимое для защиты раствора КЗ от его солевой агрегации – «золотое число» [58].

Оценку результата реакции проводят визуально и/или фотометрически. Практика свидетельствует о достаточной эффективности визуального контроля эффекта агрегации, выражающегося в заметном изменении цвета суспензии с розового на голубой. Рекомендуют построить изотерму адсорбции, фотометрически измеряя оптическую плотность золя (λ=580) после добавления убывающих концентраций зонда и раствора NaCl до конечной концентрации 1% (рис. 15)

Рис. 15 – Спектры поглощения исходного золя золота (1), золя, стабилизированного антителами (2) и после добавления NaCl (3) [56].

Из данных, представленных на рисунке 15, видно, как при стабилизации золя наблюдается увеличение и уширение пика кривой поглощения. Так, максимум пика поглощения нестабилизированного золя составляет 521 нм, оптическая плотность – 0,349; при конъюгации с антителами в концентрации 10 мкг×см^-3 максимум пика поглощения составляет 525-530 нм, оптическая плотность – 0,366. Добавление к биоконьюгату раствора NaCl до конечной концентрации 1% не приводит к изменению спектра поглощения в области 600-700 нм при концентрации антител 10 мкг×см^-3, что означает отсутствие агрегации частиц при высокой ионной силе раствора [56].

Для определения концентрации антител, оптимальной для получения стабильных, неагрегирующих конъюгатов с КЗ, проводят спектрофотометрический контроль раствора, содержащего антитела с наночастицами коллоидного золота в присутствии 10%-ного NaCl процесса, при длине волны D₅₈₀ (рис. 16).

Рис. 16 – Определение концентрации специфических антител, используемой для конъюгации с КЗ диаметром 30 нм [59].

Увеличение количества антител стабилизирует частицы КЗ, при этом D₅₈₀ возрастает, доходит до максимума и начинает снижаться, выходя на плато. Для обеспечения максимальной стабильности конъюгатов рекомендуют выбирать концентрации антител, на 10-15% превосходящие точки выхода D₅₈₀ на плато. На рисунке 16 выбранная концентрация антител (10 мкг×см^-3) отмечена стрелкой, нулевой уровень D₅₈₀ соответствует КЗ, не нагруженному антителами без добавления 10%-ного NaCl [59].

Определение «золотого числа» позволяет не только определить концентрацию антител для последующей конъюгации с наночастицами коллоидного золота, но и косвенно судить о качестве приготовленных препаратов коллоидного золота. Низкая адсорбционная способность (ниже 4 мкг×см^-3) коллоидного золота может свидетельствовать о непригодности серии препарата для последующего использования с целью приготовления конъюгата с антителами, невозможности разработки с использованием данной серии иммунохроматографической тест-системы с высокими аналитическими свойствами [60].

Таким образом, для получения одного из наиболее важных иммунохимических компонентов иммунохроматографической тест-системы (конъюгата КЗ с антителами), предназначенной для выявления Helicobacter pylori, целесообразно провести ряд последовательных экспериментальных исследований по отработке условий синтеза сферических, однородных частиц коллоидного золота размером 30 нм, наиболее оптимальных по данным литературы для приготовления конъюгата с антителами. Путем постановки «золотого числа» определить оптимальную концентрацию выбранных моноклональных антител для последующей конъюгации с экспериментально обоснованными кондиционными сериями препаратов коллоидного золота, которые были получены по разработанной в дипломной работе методике.