Дополнительные гематологические исследования

Тромбоциты

3.1.1 Методика окраски мазков крови на тромбоциты по Алексееву (подсчет по Фонио)

Принцип: Метод основан на подсчете числа тромбоцитов в окрашенных мазках крови на 1000 эритроцитов с расчетом |на 1 мкл (или 1 л) крови, исходя из содержания в этом объеме количества эритроцитов.

Реактив:рабочий раствор краски по Алексееву

Оборудование: микроскоп

Ход определения: В капилляр для определения СОЭ набирают рабочий раствор до метки 0,75 мкл, и полный капилляр крови из прокола пальца больного. Соотношение красителя к крови составляет 1:4. Смесь оставляют на 2 часа, затем делают тонкий мазок на предметном стекле. Мазок высушивают на воздухе и микроскопируют с иммерсией.

Подсчет производят следующим образом: в каждом поле зрения микроскопа считают число эритроцитов и тромбоцитов, передвигая мазок до тех пор, пока не будут просчитаны 1000 эритроцитов. Для удобства счета и большей точности следует пользоваться специальным окуляром или подбирают поле зрения, в котором имеется, например 50 эритроцитов, и просчитывают 20 полей.

РАСЧЕТ: Х=А х В / 1000

Пример: На 1000 эритроцитов подсчитано 70 тромбоцитов, а количество эритроцитов в 1 л крови (в камере Горяева) составило 4,2;

70 х 4,2 х 10 12 =294 х 10 9 /л или 294 тыс.

Нормативные величины: 180-320 х 10 9 (или от 180-320 тыс.)

Клинико-диагностическое значение:

Тромбоцитопения - снижение тромбоцитов в крови ниже нормы важный симптом геморрагического диатеза, так же при острых лейкозах, циррозе печени, ионизирующем облучении, системной красной волчанке, апластических анемиях, тяжелой железодефицитной анемии и т.д. При количестве тромбоцитов ниже 60х 10 9/л появляются симптомы кровоточивости.

Тромбоцитоз - повышение количества тромбоцитов в крови, важный симптом при злокачественных новообразованиях. Может наблюдаться при – воспалительных процессах (острый ревматизм, туберкулез, язвенный колит), острой кровопотери и т.д.

Методика определения длительности кровотечения (уколочная проба по Дуке)

Наносят более глубокий, чем обычно укол в палец (3 мм). Включают секундомер. Через 30 сек с полоской фильтровальной бумаги прикасаются к капле крови (1-ую каплю не снимают!). Постепенно капли крови на бумаге становятся все меньше и меньше и в конце концов исчезают.

Нормативная величина: В норме кровотечение составляет от 2-3-5 мин

3.1.3 Методика определения времени свертывания капиллярной крови (метод Сухарева)

Кровь берут из пальца в чистый и сухой капилляр от аппарата Панченкова. Первая капля крови содержит примесь тканевой жидкости и для исследования не пригодна. В капилляр набирают столбик крови высотой 25-30 мм и переводят ее в середину капиллярной трубки. Включают секундомер и через каждые 30 сек, наклоняют капилляр вправо и влево под углом 30-45 градусов. Кровь свободно перемещается внутри капилляра. С началом свертывания ее движение замедляется. В момент полного свертывания кровь перестает двигаться. По секундомеру отмечают моменты начала и конца свертывания.

Клинико-диагностическое значение: Начало свертывания в норме наступает в период от 30 до 2 мин, конец от З. до 5 мин.

Ретикулоциты

Ретикулоциты— молодые эритроциты, обра­зующиеся после потери нормобластами ядер. Характерной особенностью ретикулоцитов явля­ется наличие в цитоплазме зернисто-нитчатой субстанции, представляющей агрегированные рибосомы и митохондрии. Эта субстанция выяв­ляется при специальном методе окраски — суправитальном (прижизненная), т. е. без предварительной фикса­ции клеток. Зернисто-нитчатая субстанция в различных ретикулоцитах отличается полимор­физмом; чем клетка моложе, тем субстанция более обильная. У самых молодых ретикуло­цитов она имеет форму густого клубка, у более зрелых клеток выявляется в виде сеточки, от­дельных нитей и затем отдельных зерен. В маз­ках, окрашенных обычными гематологическими методами, ретикулоциты серовато-розового цве­та — полихроматофильны, т. е. окрашены раз­ными красителями.

Определение количества ретикулоцитов про­изводится при микроскопии специально окра­шенных мазков

3.2.1 Методика окраски мазков крови на ретикулоциты по Алексееву (подсчет по Фонио)

Принцип: Метод основан на подсчете числа ретикулоцитов в окрашенных мазках крови на 1000 эритроцитов. Готовят одновременно 2 мазка (на тромбоциты и ретикулоциты).

Реактив:рабочий раствор краски по Алексееву

Оборудование: микроскоп

Ход определения: В капилляр для определения СОЭ набирают рабочий раствор до метки 0,75 мкл, и полный капилляр крови из прокола пальца больного . Соотношение красителя к крови составляет 1:4. Смесь оставляют на 2 часа, затем делают тонкий мазок на предметном стекле. Мазок высушивают на воздухе и микроскопируют с иммерсией.

Подсчет производят следующим образом: сетки ретикулоцитов окрашиваются в синий цвет. Во время подсчета эритроцитов в поле зрения считают количество ретикулоцитов. Подсчитывают 1000 эритроцитов. Результат выражают в процентах.

Нормативная величина:В крови здорового человека содержится 0,2-1,0 %

( или 2-10 даже допускается до 12 проммиль) ретикулоцитов

Клинико-диагностическое значение:Появление ретикулоцитов в периферической крови указывает на усиленную работу костного мозга и используется при оценке различных видов анемий.

Повышение количества ретикулоцитов наблюдается после кровопотери, при гемолитических анемиях

Резкий ретикулоцитоз - отмечается при гемолитической желтухе

Снижение количества ретикулоцитов при наличии анемии говорит об апластическом типе кроветворения.

По уровню ретикулоцитов в крови анемии подразделяются на:

- регенераторные( количество ретикулоцитов 0,5-5 %- это постгеморрагические анемии);

- гиперрегенераторные( количество ретикулоцитов более 5% - это гемолитические анемии);

- гипо - и арегенераторные( количество ретикулоцитов снижено или они отсутствуют, несмотря на тяжелое течение анемии- гипо - и апластические, железо- и. В 12- дефицитные анемии).

Внимание! Ретикулоцитоз при отсутствии анемии указывает на скрытые, но хорошо компенсированные кровопотери.

Объем эритроцитов

Гематокритная величина, или показатель гематокрита, дает представление о соотношении между объемами плазмы и форменных элементах крови (главным образом эритроцитов), по­рученном после центрифугирования крови. Принятой гематокритной величиной выражать объем эритроцитов. В качестве унифицированных ме­тодов определения гематокритной величины (гематокрита) утверждены два метода: с помощью микроцентрифуги и микрометод в модификации Тодорова

3.3.1 Унифицированный методс помощью микроцентрифуги.

Принцип. Центрифугирование крови определенное время при постоянном числе оборотов центрифуги с последующим определением результата по специальной шкале.

Реактивы. Антикоагулянты: гепарин — ЕД/мл разводят дистиллированной водой соотношении 1: 5 или этилендиаминтетрауксусной кислоты динатриевая соль (ЭДТА Na₂, трилон Б), 40 г/л.

Оборудование. 1. Микроцентрифуга ШГ-8. 2. Капиллярные трубки (в комплекте

Ход определения. Предварительно обработанный антикоагулянтом и высушенный капилляр заполняют кровью из пальца (или венозной) на ⁷/в длины. Укупоривают капилляр с одного конца специальной пастой (можно пластилином). Помещают в ротор центрифуги, чтобы укупоренные концы упирались в резиновую прокладку, и центрифугируют 5 мин 8000 об/мин. По отсчетной шкале, приложенной к центрифуге МЦГ-8, определяют гематокритную величину.

3..3..2Унифицированный микрометод (модификации. Тодорова).

Принцип. Центрифугирование крови определенное время при постоянном числе оборотов центрифуги с после­дующим определением результата по градуиро­ванным капиллярам.

Реактивы те же.

Оборудование. 1. Центрифуга. 2. Пи­петки от аппарата Панченкова (с отрезанным верхним концом и длиной 10—11 см).

Ход определения. В обработанную антикоагулянтом и высохшую пипетку набирают кровь из пальца (или венозную) до верхней мет­ки (100 делений). Пипетку укупоривают, обтя­гивая ее резиновым кольцом, и центрифугируют 30—40 мин при 3000 об/мин. Результат отме­чают по градуировке капилляра, вычитая из 100 высоту столбика эритроцитов.

Нормальные величины. У здоро­вых гематокрит венозной и капиллярной крови равен 40—48 % (или 0,40—0,48) для мужчин и 36—42 % (или 0,36—0,42) для женщин.

Клиническое значение. Показа­тель широко используют для суждения о степени анемии, при которой, как правило, отмечается его снижение, иногда до значительных цифр (20—25 %). Выраженное повышение (55—65 %) характерно для эритремии, менее резкое увели­чение (50—55 %) наблюдается при симптома­тических эритроцитозах, сопутствующих вро­жденным порокам сердца, легочной недостаточ­ности, некоторым гемоглобинопатиям. Показа­тель гематокрита дает представление о гемокон-центрационных сдвигах, он снижается при гемодилюции. Используют гематокрит для расчетных показателей, отражающих различные характе­ристики эритроцитов: средний объем, средняя концентрация гемоглобина , а также для ряда биохимических показателей.

3.4 Осмотическая резистентность

Осмотическая резистентность (стойкость)- это устойчивость эритроцитов по отношению к гипотоническим растворам солей. В растворе с осмотическим давлением, равным осмотическому давлению крови, эритроциты не изменяются. Изотоническим раствором является раствор хлорида натрия в концентрации 0,85-0,9% . При перемещении эритроцитов в раствор с меньшей концентрации - гипотонический раствор, они набухают и гемолизируются. В гипертоническом растворе эритроциты сморщиваются , т. к вода из их выходит в раствор с большим осмотическим давлением. На этих свойствах эритроцитов основано определение их осмотической резистентности. Степень гемолиза их измеряется в гипотонических растворах хлорида натрия определенной концентрации.

3.4.1Унифицированный метод определения осмотической резистентности эритроцитов в модификации Идельсона

Принцип: Количественное определение степени гемолиза эритроцитов в за буферных гипотонических растворах хлорида натрия.

Реактив: основной раствор (27,31 г двузамещенного фосфата натрия Na;HPO<, 4,86 г однозамещенного фос­фата натрия NaH₂P04-2H₂0, 180 г хлорида натрия в 2 л дистиллированной воды); РН раствора 7,4.

По своей осмотической концентрации основной ра­створ соответствует 10% раствору хлорида натрия. Его разводят в 10 раз, получая рабочий раствор, осмотическая концентрация которого соответствует 1% раствору хлори­да натрия. Из рабочего раствора готовят разведения хлорида натрия следующих концентраций: 0,85; 0,75; 0,70; 0,65: 0,60; 0,55; 0,50; 0,45; 0,40; 0,35; 0,30; 0,20 и 0,10%. Можно готовить сразу по 100 мл этих растворов и хранить течение 2 нед в холодильнике.

Ход определения. В 2 стерильные пробирки, со­держащие по 2 капли гепарина, берут по 1,5 мл крови. 1-ю пробирку помещают на сутки в термостат, 2-ю — используют в день взятия крови.

В 14 центрифужных пробирок разливают по 5,0 мл приготовленных растворов с последовательно понижа­вшейся концентрацией. В 1-ю пробирку помещают 5,0 мл рабочего раствора с концентрацией 1%. В каждую пробир­ку прибавляют по 0,02 мл гепаринизированной крови, перемешивают и оставляют на 30 мин при комнатной температуре (20° С). Центрифугируют при 2000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость из каждой про­бирки сливают в чистую пробирку с соответствующим номером.

Фотометрируют на ФЭКе при длине волны 500—560 нм ( зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 10 мм против в холостой пробы.

Холостая проба – надосадочная жидкость в пробирке, содержащей 1 % раствор хлорида натрия.

Расчет. За 100% гемолиз принимают гемолиз в пробирке, содержащей 0,1 % раствор хлорида натрия. Вычисляют процент гемолиза в каждой пробирке, сравнивая величины экстинкции надосадочной жидкости с экстинкцией, при­нятой за 100 %, по формуле:

Ех х 100

Е1

где Е1) — экстинкция надосадочной жидкости в пробирке с 0,1 % раствором хлорида натрия; Е_х — экстинкция исследуемой пробы; 100 — про­цент гемолиза в пробирке с 0,1 % раствором хло­рида натрия.

На следующий день повторяют исследование с кровью, инкубированной 24 ч при 37 °С.

Нормальные величины. У здоро­вых в свежей крови начало гемолиза отмечают при концентрации хлорида натрия 0,48—0,46%, а полный гемолиз — при 0,34—0,32% растворе хлорида натрия.

Клиническое значение. Исследо­вание проводят при подозрении на гемолити­ческую анемию. Понижение осмотической ре­зистентности, т. е. появление гемолиза эритроци­тов при более высокой, чем в норме, концентра­ции хлорида натрия (0,70—0,75 %), наблюда­ется при наследственном микросфероцитозе и некоторых наследственных несфероцитарных ге­молитических анемиях, а также иногда при ауто­иммунной гемолитической анемии. В ряде случа­ев понижение осмотической резистентности вы­является только при исследовании инкубирован­ной крови. Повышение осмотической резистент­ности характерно для талассемии.

Раздел I V