Генетическая модификация дрожжей
Применение методов генной инженерии позволяет для оптимизации штаммов дрожжей использовать наряду с селекцией и мутацией так называемое рекомбинирование. При мутации возможно изменение лишь отдельных генов, а при рекомбинировании удается соединить гены различных микроорганизмов. При этом образуются гибриды, у которых по сравнению с исходными штаммами наблюдается улучшение или дополнение некоторых свойств: усиление бродильных свойств, изменение хлопьеобразующих свойств, возможность сбраживания более широкого спектра сахаров (в частности декстринов), сбраживание редуцированных сахаров (например, для слабоалкогольного пива), снижение образования или ускоренное расщепление диацетила, устойчивость к токсинам дрожжей-киллеров. Кроме того, в дрожжи могут быть внедрены дополнительные активные ферменты (эндо-β-глюканаза, амилаза, ами-логлюкозидазы и т. д.). Получение гибридов дрожжей может проходить через рамножение (споры) или через неполовой цикл.
Скрещивание путем размножения возможно у дрожжей лишь относительно, так как с учетом их полиплоидии (см. выше) и связанной с этим пониженной склонности к образованию аскоспор они практически не формируют клеток с выраженными типами спаривания. Лишь благодаря мутациям в гене, отвечающем за тип спаривания, можно получить как «исключение» вегетативные клетки пивоваренных дрожжей, способные к спариванию, после чего их можно скрестить с клетками противоположного типа спаривания. Именно на этом основана технология «редкого спаривания». Напротив, неполовой цикл представляет собой соединение вегетативных клеток или протопласт. Другой возможностью является трансформация - внесение генетической информации в материнскую клетку. Применение неполового (соматического) цикла или трансформации позволяет комбинировать наследственную информацию даже различных видов или родов микроорганизмов (в цикле размножения такая возможность отсутствует).
Протопластами являются клетки, стенки которых имеют такой состав ферментов, который обеспечивает их осмотическую лабильность. В гипотонических растворах они разрываются, а в гипертонических растворах сохраняют некоторое время жизнеспособность, принимая шарообразную форму. Регенерация стенки клетки происходит путем введения протопластов в гипертонический питательный агар. Клетка, ставшая после этого вновь полноценной, может вновь размножаться путем почкования. В определенных условиях протопласты способны независимо от их типа спаривания и видовой принадлежности снова сливаться друг с другом. Путем слияния протопластов можно осуществлять скрещивание пивоваренных дрожжей, в том числе пивоваренных дрожжей с дрожжами-киллерами.
Дрожжи-киллеры выделяют токсин, который при содержании дрожжей-киллеров в популяции культурных дрожжей в 1-2% способен подавить жизнедеятельность культурных дрожжей. Хотя такие дрожжи-киллеры не прекращают процесс брожения, пиво приобретает посторонний привкус (например, фенольный - см. раздел 7.4.3.3).
Особенно заметно проявляется вредное действие дрожжей-киллеров в непрерывных системах брожения. В настоящее время отсутствуют достоверные сведения о том, в какой степени при нормальном брожении на пивоваренном производстве дрожжи-киллеры способны инфицировать сусло или нарушать ход процесса брожения.
За выработку дрожжами-киллерами токсина (а следовательно, и за сопротивляемость к нему) отвечают гены, расположенные не в хромосомах ядра клетки, а в так называемой плазмиде-киллере. Эта плазмида является молекулой РНК с двойной спиралью, упакованной в белковую оболочку и присутствующей в 10-12 копиях за пределами ядра клетки в цитоплазме дрожжей-киллеров. Так как гены, отвечающие за поведение дрожжей, расположены на хромосомах ядра клетки (как и гены, которые делают дрожжи-убийцы неприемлемыми в качестве пивоваренных дрожжей, например, из-за образования постороннего привкуса, пониженной способности к брожению, неблагоприятных хлопьеобразующих свойств), то скрещивание пивоваренных дрожжей с дрожжами-киллерами следует проводить только до стадии слияния цитоплазм (плазмогамии), но не слияния ядер (кариогамии). Таким образом, происходит замена только цитоплазматических генов, но не хромосомных. Подобные гибриды в отличие от гибридов с плазмогамией и кариогамией, имеют ядро одного из «родителей» с цитоплазмой, содержащей плазмиды обоих «родителей». У гибридов с ядром клетки пивоваренных дрожжей речь идет о «желаемых» пивоваренных дрожжах-киллерах. Дрожжи с ядром дрожжей-киллеров можно обнаружить и выделить с помощью маркеров. Полученные таким способом «пивоваренные дрожжи-киллеры» обладают свойствами пивоваренных дрожжей, однако при брожении они выделяют активный токсин, служащий защитой против контаминации дрожжами-киллерами. Дрожжи-киллеры (и тем самым пивоваренные дрожжи-киллеры) невосприимчивы к некоторым токсинам отдельных рас дрожжей, например к K1.
В ходе протопластического слияния или трансформации могут вводиться чужеродные гены - например, β-1,4-глюка-назы из гифомицет. Эндо-ß-1,3- и 1,4-глю-каназы от Bacillus subtilis вносят в пивоваренные дрожжи верхового и низового брожения. При этом бродильная способность дрожжей не меняется, а устойчивость гена ß-глюканазы в дрожжах для низового брожения оказывается лучше, чем в дрожжах для верхового брожения, в частности, для производства эля.
Образование 2-ацетолактата или 2-ацетогидроксибутирата может быть снижено путем редуцирования синтеазы ацетогидроксикислот (прерывания областей кодирования). Повышение активности редуцирующих изомераз и дегид-ратаз может инициировать усиленный приток ацетогидроксикислот к валину или лейцину.
На этих примерах мы хотели показать результаты, уже достигнутые генной инженерией, и показать, каких результатов можно ожидать в ближайшем будущем. До сих пор открытым остается вопрос, не окажут ли эти модификации долговременного воздействия на общее поведение дрожжей, а также вопрос о продолжительности сохранения свойств, внесенных плазмидами. В случае пивоваренных дрожжжей-киллеров проблем в этом отношении пока не выявлено.
Автолиз дрожжей
Автолиз дрожжей происходит при неправильном их хранении, а также при определенных условиях в ходе брожения и хранения пива. Ферменты дрожжей расщепляют углеводы клетки и азотистые вещества, разрушая структуру дрожжевой клетки, а вакуоли увеличиваются за счет цитоплазмы. Субстрат насыщается аминокислотами и другими продуктами расщепления белка, особенно нуклеотидами; значение pH возрастает, особенно вследствие выделения щелочных аминокислот и связывания ионов водорода продуцируемыми фосфатами и протеинами. Кроме того, происходит выделение среднемолекулярных жирных кислот (C6-C12) И ИХ СЛОЖНЫХ эфиров, а также протеаз дрожжей и других ферментов. Первые расщепляют высокомолекулярные белковые вещества с увеличением содержания α-аминного азота, что негативно отражается на пенообразующих свойствах пива. Эти явления, происходящие в конце процесса брожения, при дображивании (особенно при повышенных температурах), а также при длительном холодильном хранении сусла с высоким содержанием дрожжей, являются лишь начальной стадией автолиза, которая органолептически проявляется в появлении резкого вкуса, отчасти напоминающего «старые дрожжи». Сильный автолиз дрожжей может вызывать появление в пиве даже привкуса креозота (см. раздел 7.4.3.3).
Метаболизм дрожжей
Как и в любом живом организме, в дрожжах происходит регулярный обмен веществ. В ходе протекающих при этом реакций энергия выделяется и потребляется, причем эти процессы взаимосвязаны. В клетке происходит накопление резервных веществ, которые при необходимости могут быть использованы. В процессе распада и синтеза веществ образуется множество промежуточных продуктов реакций и новых веществ. При отсутствии необходимых дрожжам веществ они могут синтезировать их из других соединений. В зависимости от степени необходимости такого синтеза различается также количество различных продуктов обмена веществ в субстрате. Таким образом, наряду с этиловым спиртом и углекислым газом, составляющими основную долю продуктов брожения, образуется также большое число побочных продуктов, имеющих большое значение для качества пива.
Для процессов метаболизма клетке необходима энергия, однако используется не энергия, отдаваемая в процессе брожения в виде тепла, а лишь химическая энергия соединений клетки. Важнейшими из них являются аденозиндифосфат (АДФ) и аденозинтрифосфат (АТФ), служащие своего рода аккумуляторами и передатчиками энергии. Из 2870 кДж (686 ккал), образующихся при сжигании одной молекулы глюкозы, при дыхании химически связывается около 40 % (1110 кДж или 266 ккал), тогда как при брожении затраты энергии несопоставимо меньше (80 кДж или 19 ккал).
Метаболизм углеводов
В пивном сусле из пригодных для утилизации дрожжами углеводов присутствуют гексозы - глюкоза и фруктоза, дисахариды сахароза и мальтоза, а также трисахарид мальтотриоза.
Низкомолекулярные и высокомолекулярные декстрины дрожжами не потребляются. Глюкоза и фруктоза диффундируют через клеточную стенку и преобразуются внутри дрожжевой клетки по механизму, который мы рассмотрим ниже. Сахароза расщепляется инвертазой в области клеточной стенки до глюкозы и фруктозы. Мальтозе же и мальтотриозе, чтобы попасть внутрь клетки, где они гид-ролизируются мальтазой до глюкозы, требуется специальная транспортная система
с использованием ферментов мальтосе-пермеазы и мальтотриосепермеазы. Если дрожжи адаптированы к мальтозе и мальтотриозе (как, например, в конце главного брожения, когда дрожжи сразу же вновь вносятся в следующую порцию сусла), утилизация этих разных видов Сахаров дрожжами затем идет примерно параллельно. Если до повторного внесения дрожжи хранятся под водой, то адаптация к мальтозе утрачивается, и дрожжи сбраживают сахара в описанной выше последовательности.
Расщепление глюкозы в анаэробной среде до спирта и CO2 или аэробным путем - до CO2 и воды происходит следующим образом (мы приводим упрощенный вариант), причем до образования пировиноградной кислоты (фаза 9) пути спиртового брожения и дыхания протекают параллельно.
3.2.1.1. Схема спиртового брожения по Эмбдену-Мейергофу-Парнасу (Embden-Meyerhof- Parnas):
1. Глюкоза переводится гексокпназой в гликозо-6-фосфат. В качестве донора фосфата выступает АТФ, который превращается при этом в менее богатый энергией АДФ.
2. В следующей фазе под действием фермента фосфогексозоизомеразы происходит перегруппировка во фруктозо-6-фосфат.
3. В результате дальнейшего фосфорилирования под действием фосфофруктокиназы и АТФ (в качестве Р-донора) наряду с АДФ образуется фруктозо-1,6-дифосфат.
4. Затем фруктозо-1,6-дифосфат расщепляется альдолазой на два изомерных трифосфата - глицераль-3-фос-фат и глицерон-3-фосфат, которые находятся в обратимом равновесии (1 : 22) и катализируются триозофосфатизомеразой.
5. В дальнейшем происходит превращение глицераль-3-фосфата, который восстанавливается ферментом глицеральдегидро-3-фосфат-дегидро-геназы в две молекулы 1,3-дифос-фоглицерата. При этом в связь встраивается неорганический фосфат. Для высвободившегося водорода акцептором служит НАД+ (никотинамид-аденин-динуклеотид).
6. В дальнейшем фосфоглицераткиназа вызывает передачу фосфата гидроксильной группы и образуется 3-фос-фоглицерат, причем АДФ переходит в АТФ.
7. Под действием фосфоглицератмутазы происходит перегруппировка фосфата и образуется 2-фосфоглицерат.
8. Энолаза катализирует переход к фосфоенолпирувату.
9. Пируваткиназа переводит две молекулы фосфоенолпирувата в две молекулы пирувата, и АДФ снова преобразуется в АТФ. Глицерон-3-фосфат (фаза 4) может быть преобразован в глицеральдегид-3-фосфат (ферментом триозофосфатизомеразой), а затем также пройти фазы от 5 до 9. Происходит разделение хода реакции анаэробного и аэробного гликолиза. Гликолиз продолжается по анаэробному пути.
10. Под действием пируватдекарбоксилазы происходит необратимое декарбо-ксилирование карбоксильной группы пирувата в ацетальдегид с высвобождением СО2.
11. Катализированный алкогольдегидрогеназой ацетальдегид редуцируется до этилового спирта. Донором водорода здесь служит НАД H2 (из 5 фазы цикла).
3.2.1.2. Дыхание. Как мы уже отмечали, аэробный обмен веществ до фазы 9 протекает параллельно анаэробному. Если на этой стадии присутствует кислород, то дальнейшее расщепление протекает по циклу лимонной кислоты (циклу Кребса): 10а) Пируват коферментом A (CoA) переводится сложным способом через отщепление CO2 в ацетил-СоА - активированную уксусную кислоту. При этом НАД+ восстанавливается в НАД H2. 11а) С помощью оксалацетата ацетильная группа активированной уксусной кислоты превращается в лимонную кислоту.
12. Под действием аконитгидратазы через цисаконитовую кислоту в две стадии образуется изолимонная кислота.
13. Изоцитрат-дегидрогеназа катализирует при участии НАД+ или НАД P+ (никотинамид-аденин-динуклеотидфосфата) дегидратацию в оксалосук-цинат (щавелево-янтарную кислоту).
14. Благодаря той же дегидрогеназе щавелево-янтарная кислота декарбоксилируется в 2-оксоглутарат (а-кетоглутаровую кислоту) с высвобождением CO2.
15. Благодаря комплексу из трех ферментов (а-кетоглутарат-декарбоксиназа, липоилредуктаза-транссукцинилаза и дегидролипоил-дегидрогеназа) происходит окислительное декарбо-ксилирование до янтарной кислоты. При этом благодаря коферменту А в качестве промежуточного продукта образуется сукцинилкоА.
16. Янтарная кислота дегидрируется дегидрогеназой янтарной кислоты до фумаровой кислоты.
17. Благодаря присоединению воды фумараза (фумаратгидратаза) способствует образованию яблочной кислоты.
18. Цикл завершается дегидрированием яблочной кислоты (малатдегидроге-назы) в щавелево-уксусную кислоту и повторяется с окислительным расщеплением ацетильной группы. Энергетический баланс цикла лимонной кислоты (обратимого) сбалансирован. Отщепляемые атомы водорода окисляются кислородом воздуха до воды. При этом вновь образуются богатые энергией фосфатные связи (АТФ), обеспечивающие этот круговорот или другие процессы. Из каждой молекулы глюкозы, которая окислительным путем расщепляется на CO2 и H2O, образуется 38 молекул АТФ. При анаэробном расщеплении по пути спиртового брожения расходуется всего 2 молекулы АТФ на 1 моль глюкозы.
Помимо приведенной выше схемы известен еще один способ расщепления глюкозы.
3.2.1.3. Пентозо- или гексозо-монофос-фатный цикл. В этом цикле расщепление глюкозы до CO2 осуществляется путем прямого окисления. Это происходит за счет окислительного декарбоксилирования глюкозо-6-фосфата в рибулозо-5-фосфат, причем редуцируются две молекулы трифосфоридиннуклеотида (НАД Р), которые затем окисляются кислородом при дыхании. В результате могут образовываться богатые энергией фосфатные связи. В конечном итоге из трех пентозо-фосфатов возникают 2 гексозы (фрукто-зо-6-фостат и глюкозо-6-фосфат) и одна триоза. Гексозы затем могут быть снова подвергнуты прямому глюкозному окислению.
После многократного повторения этого цикла глюкоза может полностью окислиться. В анаэробных условиях этим путем расщепляется лишь 10 % глюкозы, а в аэробных дрожжах по пентозофос-фатному циклу метаболизируются 26 %.
Как и в схеме Эмбдена-Мейергофа-Парнаса, так и в пентозо-фосфатном цикле отдельные промежуточные продукты реакций имеют большое значение в жизнедеятельности дрожжей для обмена «строительными материалами». Так, дрожжи идут по этому пути, если для синтеза нуклеиновых кислот требуется пентозо-фосфат или редуцированный НАДР.
Дрожжи обладают способностью приспособить обмен веществ как к анаэробным, так и к аэробным условиям. Хотя первый вариант является более предпочтительным, при наличии кислорода брожение сильно замедляется или совсем прекращается, так как кислород расходуется на дыхание (эффект Пастера). Так как при брожении для метаболизма отсутствует необходимость в дыхательных ферментах, то дрожжи вырабатывают их только через мембранную систему метохондрий.
В аэробных культурах дрожжей, наоборот, небольшая часть глюкозы сбраживается в спирт и CO2. Высокое содержание глюкозы замедляет работу дыхательного ферментного комплекса, и брожение происходит вместе с дыханием (эффект Кребтри).
При обычном брожении в пивоварении сбраживается примерно 98 % Сахаров, и на дыхание расходуются лишь 2 %.
3.2.1.4. Синтез углеводов, в частности гликогена, осуществляется под действием трансглюкозидаз и фосфорилаз. При этом дрожжи образуют резервные углеводы (гликоген и трегалозу) только в анаэробной фазе, то есть после завершения размножения дрожжей. Образование гликогена соответствует примерно 0,25 % потребления мальтозы.
Количество гликогена как резервного углевода в первые 2 ч брожения снижается с 40 % (в пересчете на CB) до 20 % (см. раздел 3.1.2.2). Наряду с этим дрожжи вырабатывают маннан и глюкан, необходимые для образования клеточных стенок.