Различия неорганических катализаторов и ферментов
| Показатель | Неорганические катализаторы | Ферменты |
| Химическая природа | Низкомолекулярные вещества, состоящие из одного или нескольких химических элементов | Белки – высокомолекулярные полимеры, состоящие из тысячи атомов |
| Специфичность | Низкая | Высокая |
| Оптимум температуры | Высокий (100˚С и выше) | Низкий (35 - 45˚ С) |
| Оптимум рН | Сильнокислая или сильнощелочная среда | Физиологический диапазон рН среды |
| Давление | Выше атмосферного | Атмосферное (норма) |
| Изменение структуры катализатора в ходе реакции | Не изменяется | Может изменяться и восстанавливаться в исходную структуру по окончании реакции |
| Увеличение скорости | В 102 – 106 раз | В 108 – 1011 раз |
Требования к ферментам, используемым в клинико-биохимических исследованиях.
1. Органоспецифичность.
2.Низкая активность в крови в норме.
3. Выход в кровь только при повреждении соответствующего органа.
4. Высокая стабильность в крови (не менее 1-2 часов).
5. Доступная методика определения активности фермента.
Каскады, циклы и цепи химических реакций, лежащих в основе процессов жизнедеятельности, катализируются ферментами, без участия которых жизнь невозможна. Они – основа здоровья и болезней. Нарушение функции даже одного из них влечет за собой значительные нарушения последующих и сопряженных реакций. Определение активности внутриклеточных ферментов, поступающих при патологических процессах в межклеточную жидкость и кровь, широко используется локализации патологического процесса и степени его развития. Во многих случаях ферменты – это лекарственные препараты, необходимые для лечения. В лабораторной практике они нашли применение как реактивы для количественного определения отдельных органических веществ в сложных смесях с другими соединениями.
В диагностике заболеваний определению активности ферментов придается большое значение. Оптимальные условия проведения ферментативной реакции:
1) установление рН-оптимума фермента путем использования соответствующего буферного раствора с гарантией поддержания рН на постоянном уровне во время реакции;
2) удаление из зоны реакции ингибирующих веществ;
3) поддержание постоянной температуры во время проведения реакции;
4) добавление в достаточном количестве коферментов;
5) обеспечение избытка субстрата.
Избыток субстрата гарантирует измерение максимальной скорости реакции и устраняет падение активности фермента из-за потребления субстрата. Условия проведения реакции должны строго соблюдаться. Помимо определения активности ферментов с диагностической целью, имеет значение и определение количества субстратов с помощью препаративно изолированных ферментов. Для этого к определенному субстрату добавляют избыток фермента в оптимальных для реакции условиях. Затем полученный продукт определяют специальными методами.
Например, использование фермента в реакциях превращения глюкозы основано на свойстве субстратной специфичности и исключает участие в химической реакции других сахаров. В этом случае определяется концентрация только глюкозы. Ферментативными методами определяют концентрацию ТАГ, мочевины, холестерина и др. субстратов.
Ферменты неравномерно распределены внутри клеток. Они связаны с определенными структурами и местами в клетке, которые выполняют определенную роль в обмене веществ и тесно взаимосвязаны друг с другом. Многие ферменты тесно связаны со структурными белками в данном отсеке клетки. В некоторых случаях едва ли возможно различить белок фермента и структурный белок. Такая жесткая фиксация ферментов со структурными образования клетки характерна не для одного, а для целой группы ферментов, которые катализируют цепь метаболических превращений. Ферменты и структурные белки тесно связаны в митохондриях. Во внутренней мембране локализованы функциональные единицы – комплексы ферментов дыхательной цепи и окислительного фосфорилирования. Они обеспечивают получение и накопление энергии. Комплексы реакций окисления жирных кислот и цикла Кребса протекают также в митохондриях. Таким образом, в митохондриях сосредоточен целый ряд мультиферментных комплексов. Тесный контакт ферментов и субстратов в мультиферментных комплексах благоприятствуют быстрому протеканию реакций.
Первичные лизосомы, пузырьковые образования, содержимое которых состоит из ферментов, катализирующих распад клеточных составных частей. Неконтролируемое действие этих ферментов после разрушения первичных лизосом может привести к растворению клетки. В нормальных условиях действие лизосомных ферментов контролируется. При повреждении клеток и после их гибели ферменты выходят из первичных лизосом и вызывают растворение клетки (аутоцитоз). Мембраны ЭПС содержат ферменты для синтеза ТАГ и сложных липидов.
Гиалоплазма (цитозоль) – жидкое содержимое клеток, которое омывает все органеллы и заключено в мембрану. Там происходит синтез и распад углеводов, синтез жирных кислот, ряд подготовительных реакций для получения энергии в митохондриях.
Роль коферментов могут выполнять различные соединения: коферменты – нуклеотиды, коферменты – металлы, коферменты – производные водорастворимых витаминов, липоевая кислота, убихинон. Особо важное значение имеют коферменты – производные водорастворимых витаминов, так как протекание реакций, катализируемых ферментами с такими коферментами, зависит от поступления витаминов с пищей.
Коферменты, содержащие тиамин, образуются путем фосфорилирования витамина В1. Хорошо установлена роль тиаминдифосфата, известного также под названием тиаминпирофосфат (ТПФ), или кокарбоксилаза. Он участвует в реакциях простого окислительного декарбоксилирования альфа-кетокислот, входит в состав транскетолазы (пентозофосфатный путь окисления глюкозы).
Коферменты, содержащие пантотеновую кислоту (витамин В5). Пантотеновая кислота входит в состав кофермента А (КоА-SН). Этот кофермент участвует в реакциях переноса остатка кислоты (ацила). Наиболее значим в клетках остаток уксусной кислоты – ацетил. Ацетил – кофермент А (СН3-СО~S-КоА) – это соединение, которое объединяет между собой обмен разных веществ в клетке.
Коферменты, содержащие витамин РР (никотинамид, витамин В3). Витамин РР входит в состав НАД и НАДФ, которые входят в состав дегидрогеназ, катализирующих окислительно-восстановительные реакции. Они выполняют роль промежуточных акцепторов электронов и протонов.
Коферменты, содержащие рибофлавин. Они образуются путем фосфорилирования или аденилирования витамина В2. Различают 2 кофермента, содержащих рибофлавин – ФМН и ФАД – они участвую в окислительно-восстановительных реакциях. Коферменты образуются путем фосфорилирования двух производных пиридина – пиридоксаля и пиридоксамина. Ведущим коферментом является пидоксальфосфат, участвующий в реакциях трансаминирования, декарбоксилирования и др.
Коферменты, содержащие витамин Вс. (фолиевая кислота), в своем составе витамин Вс содержит еще один витамин – парааминобензойную кислоту, которая соединяется с птеридином и глутаминовой кислотой. Коферментной формой является тетрагидрофолиевая кислота, которая участвует в реакциях переноса фрагментов органических молекул, содержащих один углеродный атом, необходимых для синтеза нуклеотидов, аминокислот, липидов.
Коферменты, содержащие витамин В12, который входит в состав коферментов – метилкобаламин и 5´-дезоксиаденозилкобаламин.
Метилкобаламин участвует в реакциях переноса метильных групп, которые становятся важными источникамиодноуглеродных фрагментов, а 5´-дезоксиаденозилкобаламин участвует в реакциях изомеризации.
Биотин (витамин Н) образует активную форму – карбоксибиотин, который участвует в реакциях карбоксилирования и транскарбоксилирования.
Коферменты – производные водорастворимых витаминов приобретают большое значение еще и потому, что в их состав входят вещества, которые не могут синтезироваться клетками человека и многих животных. Поэтому протекание реакций, катализируемых ферментами, в состав коферментов которых входят витамины, зависит о поступления витаминов с пищей.
В клинической практике широко используется определение активности двух трансаминаз. В диагностике инфаркта миокарда применяют определение активности аспартат-аминотрансферазы (АсАТ), а для диагностики и оценки эффективности лечения некоторых болезней печени используют определение активности аланин-аминотрансферазы (АлАТ), что связано с неравномерным распределением этих ферментов в разных органах и тканях и даже в разных субклеточных фракциях (табл.).
Таблица.
Относительное распределение активности ферментов АсАТ и АлАТ
(в условных единицах)
| АсАТ | АлАТ | |
| Сердце Печень Почки Эритроциты Лёгкие Плазма |
Две трети всей активности АсАТ клетки приходятся на митохондрии, а для АлАТ – на цитоплазму. При незначительных нарушениях функций клетки в кровь переходят цитозольные ферменты. При значительных повреждениях в кровь могут переходить митохондриальные ферменты. Учёные обратили внимание на значение определения активности трансаминаз при инфаркте ещё в 1954 г. Активность АсАТ повышалась через 2-6 ч после инфаркта, достигала максимума через 24-48 ч и затем в течение недели возвращалась к исходным значениям. Несомненно, ЭКГ – более эффективное средство диагностики, чем определение активности АсАТ. Однако при диагностике повторных инфарктов, определение активности АсАТ оказывает хорошую помощь в диагностике.
При острых поражениях печени типичным будет повышение активности АлАТ, а также и других ферментов (АсАТ, ЛДГ), однако коэффициент АсАТ/АлАТ будет меньше единицы. При инфаркте миокарда активность АсАТ значительно увеличивается и АсАТ/АлАТ > 1. Повышение активности АлАТ обычно наблюдается при повреждении паренхиматозных клеток печени (повреждения клеток вызывают вирусы, грибные яды, этанол). Активность АлАТ повышается к 3-м суткам и поддерживается на повышенном уровне в течение 30-40 дней. При поражении желчевыделительных путей активность АлАТ обычно повышается незначительно.
АсТ-белок с М = 111000 Д
АсТ представлена отдельными изоэнзимами, составляющими две основные формы фермента – митохондриальную и растворимую, содержащиеся как в митохондриях, так и в цитоплазме.
Митохондриальная форма энзима составляет около 12% общей активности АсТ. В печени на долю митохондриальной формы АсТ приходится 81% от общей активности фермента (ц-АсТ – растворимая в цитозоле, м-АсТ – митохондриальная).
Ц-АсТ представлена двумя идентичными субъединицами, являясь димером с молекулярной массой 93 кД.
Наиболее богатыми источниками АсТ являются сердце, печень, скелетная мускулатура, нервная ткань и почки; в поджелудочной железе, селезёнке и лёгких АсТ обнаруживается в меньших количествах.
Аспартат-аминотрансфераза обратимо катализирует реакцию: COOH COOH COOH COOH | | | | HC – NH2 C = O C = O CH – NH2 | | АсТ | |   CH2 + CH2 CH2 + CH2 | | | | COOH CH2 COOH CH2 | | COOH COOH α-аспартат α-кетоглутарат ЩУК α-глутамат |
АлТ является второй важной аминотрансферазой, выделенной из тканей человека и хорошо изученной. АлТ присутствует во многих органах: печени, почках, скелетных мышцах, миокарде, поджелудочной железе. АлТ присутствует в клетках в форме двух изоферментов – цитозольного и митохондриального, но последний является нестабильным, да и содержание его в клетках низкое.
Аланинаминотрансфераза обратимо катализирует реакцию:
COOH COOH | | COOH C = O COOH CH – NH2 | | АлТ | |   CH – NH2 + CH2 C = O + CH2 | | | | CH3 CH2 CH3 CH2 | | COOH COOH α-аланин α-кетоглутарат пируват α-глутамат |
Клиническое значение определения активности аминотрансфераз
Повышение активности аминотрансфераз в сыворотке отмечено при поражении органов и тканей, богатых данными ферментами (печень, миокард и др.).
Наиболее резкие изменения в активности АсТ наблюдаются при поражении сердечной мышцы. При инфаркте миокарда активность АсТ в сыворотке крови может увеличиваться в 2-20 раз. Нередко повышение активности АсТ предшествует появлению типичных признаков инфаркта на ЭКГ.
Некроз клеток значительно поднимает активность АсТ в сыворотке крови.
Ряд исследователей подчёркивает прогностическую ценность определения активности АсТ. Если после 3-4-х дней заболевания активность АсТ не снижается, то прогноз плохой. При стенокардии активность АсТ остаётся в пределах нормы.
При заболеваниях печени наиболее значительно изменяется активность АлТ. Установлено, что повреждение всего одной печёночной клетки из 750 достаточно для значительного увеличения активности сывороточной АлТ. Особенно резко повышается активность АлТ в сыворотке крови при инфекционном гепатите. Максимум повышения активности фермента отмечается на 6-10-й день заболевания и постепенно возвращается к норме к 15-20-му дню. Активность АлТ повышается и при безжелтушных формах болезни Боткина. Механические желтухи, холангиты и др. заболевания печени обычно не сопровождаются значительным повышением активности аминотрансфераз.
Метастазы рака в печень характеризуются гипераминотрансфераземиями. Повышение активности АлТ имеет место и при остром инфаркте миокарда, оно не столь резкое по сравнению с активностью АсТ. Одновременное определение активности АсТ и АлТ является ценным диагностическим тестом. Соотношение АсТ/АлТ – коэффициент де Ритиса, он равен 1,33 ± 0,42. У больных инфекционным гепатитом происходит снижение коэффициента, а при остром инфаркте величина этого коэффициента резко возрастает.
При дифференциальной диагностике заболеваний печени важное значение имеет коэффициент Шмидта (АсТ + АлТ) / ГлДГ. Активность глутаматдегидрогеназы (ГлДГ) повышается незначительно при остром паренхиматозном гепатите, но резко увеличена активность аминотрансфераз.
Для механических желтух характерны значительный подъём активности ГлДГ и небольшое увеличение активности аминотрансфераз.
Лактатдегидрогеназа
Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) – гликолитический (цитозольный цинкосодержащий) фермент, М = 135000 Д, обратимо катализирующий окисление L-лактата в пируват. Непременный участник данной реакции – окисленный НАД+, используемый в качестве кофактора фермента, играющего роль акцептора водорода.
Реакция, катализируемая ЛДГ, может быть представлена в следующем виде:
CH3 CH3 | + НАД+ |   CHOH C = O + НАД · H + H+ (НАДН2) | | COOH COOH L-лактат пируват |
Фермент широко распространён в организме человека. По степени убывания активности энзима органы и ткани могут быть расположены в следующем порядке: почки, сердце, скелетные мышцы, поджелудочная железа, селезёнка, печень, лёгкие, сыворотка крови. В сыворотке крови обнаружено несколько изоферментов, обладающих каталитическими свойствами этого фермента. Изменения в строении белковой части изоферментов обусловливают их различные физико-химические свойства (например, неодинаковую электрофоретическую подвижность).
В плазме (сыворотке) крови выявлено пять изоферментов ЛДГ – ЛДГ1, ЛДГ2, ЛДГ3, ЛДГ4, ЛДГ5. Каждый из изомеров представляет собой тетрамер, образованный субъединицами H и M. Установлено, что фракция ЛДГ1 происходит в основном из ткани сердца, ЛДГ5 – из печени. ЛДГ в цитоплазме клеток и сыворотке крови представлена 5-ю изоферментами. Это количество обусловлено наличием 2-х генетических локусов, которые кодируют синтез 2-х олигомеров – субъединицы M (muscle) и субъединицы H (heart). Комплексуясь в тетрамеры, субъединицы образуют 5 изоформ, обозначаемых в соответствии с их подвижностью в электрическом поле: ЛДГ1 (HHHH), ЛДГ2 (HHHM), ЛДГ3 (HHMM), ЛДГ4 (HMMM) и ЛДГ5 (MMMM).
Шестой изофермент ЛДГ-X встречается в яичках взрослых особей наряду с пятью изоферментами, которые обнаруживаются в других тканях. ЛДГ-X (XXXX), субъединицы X отличаются по аминокислотному составу от H- и M-субъединиц. Считают, что этот изофермент связан со сперматогенезом. 80% активности ЛДГ сперматозоидов обусловлено этим изоферментом.
Клинико-диагностическое значение определения общей активности
ЛДГ и её изоферментов
Фермент ЛДГ содержится практически во всех тканях. Констатация повышения общей активности лактатдегидрогеназы не имеет большого значения для дифференциальной диагностики заболеваний внутренних органов.
Повышение активностилактатдегидрогеназы. Активность ЛДГ в сыворотке крови возрастает у больных, страдающих анемией (гемолитической, пернициозной, мегалобластной, серповидно-клеточной), обширным карциноматозом, опухолями, лейкозами, лимфомой, вирусным и невирусным гепатитом, обтурационной желтухой, циррозом печени, различными заболеваниями почек, опорно-двигательного аппарата, инфарктом миокарда и лёгкого, а также при любом другом повреждении клеток, приводящем к цитолизу и утрате цитоплазмы (этот фермент, широко представленный в тканях организма, легко переходит в плазму крови при некробиотических процессах в клетках).
При остром гепатите активность лактатдегидрогеназы в сыворотке крови увеличена в первые недели желтушного периода, процент мочевиностабильной фракции ЛДГ падает (менее 20%). Относительная активность изоферментов ЛДГ4 и ЛДГ5 повышена у всех больных инфекционным гепатитом в первые 10 сут.
По данным Натальсона, у больных инфарктом миокарда активность фермента в сыворотке крови повышалась через 8-10 ч после начала приступа, достигая максимума через 24-28 ч, оставалась увеличенной на протяжении первой недели заболевания, нормализуясь к 8-9-м сут. Характерно, что общая активность сывороточной ЛДГ у больных инфарктом миокарда сохранялась повышенной вдвое дольше, чем активность других ферментов. Ценность данного теста особенно велика в неясных случаях заболевания, при нетипичной клинической и электрокардиографической картине инфаркта миокарда.
Установлена достоверная прямая корреляционная связь между размером очага омертвения в миокарде и общей активностью ЛДГ. Инфаркт миокарда сопровождается возрастанием (более 40%) мочевиностабильной фракции ЛДГ. Повышение её содержания указывает на наличие острого инфаркта задолго до его электрокардиографического подтверждения. Увеличение уровня этой фракции наблюдается ещё в предынфарктном состоянии.
Исследование общей активности ЛДГ и фракционного состава изоферментов имеет не только диагностическое, но и прогностическое значение. При мелкоочаговом инфаркте миокарда сдвиг активности ЛДГ умеренный. При высоком уровне ЛДГ следует опасаться неблагоприятного исхода заболевания, так как это обычно свидетельствует о наличии обширного, нередко трансмурального инфаркта миокарда. Нормализация общей активности ЛДГ далеко не всегда сопровождается снижением уровня ЛДГ1 (или мочевиностабильной фракции ЛДГ). Иногда наблюдается уменьшение общей активности ЛДГ до нормальных величин, в то время как снижение уровня ЛДГ1 может затягиваться до трёх недель и, по-видимому, отражает замедление процесса репарации.
Изменённая уже в первые сутки развития инфаркта величина отношения изоферментов ЛДГ1/ЛДГ2 достигает обычно нормальных значений на 31-34-е сут. Болезни, в ряде случаев нормализация этого коэффициента затягивается на более длительный период времени.
Следует отметить, что увеличение общей активности ЛДГ или отношения ЛДГ1/ЛДГ2 наблюдается не только при остром инфаркте миокарда, но также гемолизе любого происхождения (in vivo и in vitro), анемии (гемолитической, пернициозной, серповидноклеточной, мегалобластной), остром некрозе почек. К повышению содержания ЛДГ1 приводят опухолевые поражения зародышевых клеток (тератома, семинома яичка, дисгерминома яичника), к увеличению уровня ЛДГ5 – многие заболевания печени (гепатиты, цирроз и др.), повреждения скелетных мышц, злокачественные новообразования. Осложнения инфаркта миокарда сопровождаются дополнительным повышением активности ферментов.
Тромбоз лёгочной артерии характеризуется преимущественным увеличением активности ЛДГ3 и менее значительным – ЛДГ4. Активность ЛДГ3 возрастает при почечных заболеваниях, поражениях сердечно-сосудистой системы с преобладанием недостаточности в малом круге кровообращения, вызывающих нарушение метаболических процессов в лёгочной ткани. Застой крови в большом круге кровообращения приводит к повышению содержания фракций ЛДГ4 и ЛДГ5, что в основном обусловлено гипоксией печени.
К увеличению общей активности ЛДГ приводит приём алкоголя, кофеина, введение анаболических стероидов, тестостерона, обезболивающих препаратов, дикумарина, хинидина, сульфаниламидов, кодеина, клофибрата, мисклерона.
Снижение активности лактатдегидрогеназы. В последнее время описано много случаев низкой активности ЛДГ в сыворотке крови. Существует две группы причин, обусловливающих снижение активности фермента в крови и тканях. Одна из них связана с наличием ингибитора в сыворотке (плазме) крови, вторая – с генетическими нарушениями. Действительно, в сыворотке крови даже практически здоровых людей существует термозависимый ингибитор, присутствие которого снижает активность ЛДГ. При исследовании 20 000 образцов сыворотки крови выявлено 42 случая низкой активности ЛДГ. В качестве ингибиторов активности ферментов крови выступают IgG, IgA, IgM.
Уменьшение активности ЛДГ вызывают оксалаты (используемые в качестве антикоагулянтов) и мочевина.
Таблица 1.