Эксперименты Монтанье по изоляции

В своем документальном фильме 2012 года ≪Дом чисел?≫ Брент Леунг брал интервью у Монтанье и Барре-Синусси

Леунг: В чем цель очистки?

Монтанье: Чтобы убедиться, что это реальный вирус

Леунг: Возвращаясь в 1983 год, когда пробовали доказать существование нового вируса, почему очистка была важной?

Барре-Синусси: Было важно приготовить наборы для определения антител. ОК? Потому что мы хотели чтобы эти наборы были настолько специфичны, насколько это возможно. Если вы используете препарат вируса, который не очищен, конечно, вы определите антитела ко всему, не только к вирусу, но также против белков, которые производятся в надосадочной жидкости… Теперь когда вирус [ВИЧ] в этой надосадочной жидкости [клеточной культуры] он не очищен. ОК? Потому что клетки высвобождают кучу всего, не только вирус…клеточные белки… и так далее, ОК?… итак это значит, что надосадочная жидкость, которая у вас есть, это смесь всего, включая вирус. Теперь вам нужно ее очистить… ОК… это второй шаг… затем вы пытаетесь очистить вирус из всей этой мешанины.

Первые два эксперимента, включающие энзим обратную транскриптазу, включали в себя ошибку, которая стала вездесущей в исследованиях «ВИЧ»

Первый эксперимент Монтанье

Метод: Монтанье культивировал Т-лимфоциты, полученные из лимфоузла, вырезанного у пациента BRU. BRU ≪был 33-летним гомосексуальным мужчиной, который обратился за медицинской консультацией в декабре 1982 года в связи с увеличением шейных лимфоузлов и общей слабостью… Обследование показало увеличение подмышечных и паховых лимфоузлов. Не были отмечены ни жар, ни потеря веса. Пациент несколько раз болел гонореей и лечился от сифилиса в сентябре 1982 года. Во время опроса он отметил, что имел более 50 партнеров в год и путешествовал во многие страны».

К культуре лимфоцитов BRU было добавлено множество реактивов, включая митоген фитогемагглютинин (ФГА). «Образцы регулярно забирались для анализа на обратную транскриптазу и для исследования на электронном микроскопе».

Результат: определение активности обратной транскриптазы в культуре. Изображения с электронного микроскопа не опубликованы.

Интерпретация Монтанье: «производство вируса». BRU заражен ретровирусом.

Комментарии

В 1971 году нобелевский лауреат Говард Темин (Howard Temin), первооткрыватель обратной транскриптазы, сообщил об изоляции обратной транскриптазы из неинфицированных клеток крысы и заключил, что активность обратной транскриптазы (RT-активность) «Не обязательно представляет онкогенные [ретро] вирусы»³⁷. В 1976 году никто иной, как Галло, показал, что обратная транскриптаза встречается в нормальных, НЕ зараженных вирусом клетках, стимулированных ФГА³⁸. Митогенная стимуляция (ФГА или другими митогенами) обязательна в экспериментах по «изоляции» ВИЧ: феномен, который, как утверждается, говорит об изоляции ВИЧ, не появляется без митогенной стимуляции. Некоторые часто встречающиеся микробы, включая бактерии³⁹ и вирус гепатита B (обычная инфекция для пациентов, болеющих СПИДом, включая их T4-клетки⁴⁰), занимаются обратной транскрипцией. Текущий список их более чем ста, ретро-транскрибирующих (обратно транскрибирующих) вирусов ЗДЕСЬ: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?p=7&id=35268

В Доме Чисел, нобелевский лауреат Дэвид Балтимор (David Baltimore) сказал Леунгу, «обратная транскрипция очень широко распространена»⁴¹. В Австралии в 2001 году неспецифичность обратной транскриптазы была опубликована только в статье в рыночном журнале, оценивающей инвестиционный потенциал биотехнологических компаний⁴². До сих пор научная литература о ВИЧ/СПИДе наполнена заявлениями об определении, передаче, изоляции и даже подсчете ВИЧ, основанными только на определении активности обратной транскриптазы^43,44. В 1997 году Яап Хаутшмит (Jaap Goudsmit), один из известнейших экспертов по ВИЧ, утверждал: «лимфоузел BRU был первым культивирован в январе 1983 года, и 15 января из него выделили энзим, уникальный для группы лентивирусов [ретровирусов]»⁴⁵. Несмотря на все свидетельства обратного (большинство из них их собственные из 70-х годов), ведущие эксперты по ВИЧ до сих пор утверждают, что обратная транскриптаза специфична для ретровирусов.

На самом деле, во время интервью с французским журналистом-документалистом Джамелом Тахи (Djamel Tahi,), коллега Монтанье Жан-Клод Шерман сказал: «Второе дело относится к определению активности обратной транскриптазы, специфичного для ретровирусов энзима» (Д. Тахи, во время личного общения). В 2006 году эксперт по ВИЧ Дэвид Хо (David Ho ) сказал в интервью PBS:

«Обратная транскриптаза это энзим ретровирусов… один способ взглянуть на ретровирусы это просто измерить возможность обратной транскрипции, и на самом деле это как Барре-Синусси и ее коллеги открыли ВИЧ… Они показали эту RT-активность как передающуюся в клеточной культуре»⁴⁶.

Для Монтанье определение активности обратной транскриптазы значило ВИЧ-инфекцию BRU. То же самое заключение утверждалось всеми другими исследователями ВИЧ, включая Галло и его коллег в 1984, выполнявших похожие эксперименты на своих пациентах. На самом деле, интерпретация активности обратной транскриптазы в качестве ретровируса противоречит научным данным. Во время интервью Тахи в июле 1997 в институте Пастера Монтанье правильно сослался на «RT-активность, энзима, характеризующего ретровирусы»⁴⁷. Он не сказал специфичной «для ретровирусов».

Все эксперименты Монтанье выполнялись, используя либо некачественный контроль, либо без контроля. Контроль является важной частью научно обоснованного эксперимента, разработанный, чтобы показать, что фактор, который проверяется, на самом деле ответственен за наблюдаемый эффект. В контрольном эксперименте все факторы, кроме того, который проверяется, точно такие же как и в тестовых экспериментах, и выполняются точно такие же измерения. Использование контроля элементарно и, в случае ретровирусов, решающе. В экспериментах Монтанье контролем было то, что доказывало бы, что феномен, интерпретированный как «ретровирусный», такой, как RT-активность, это не результат непредусмотренных, искажающих неретровирусных факторов или экспресии эндогенных ретровирусов⁴⁸, которые присутствуют во всех нас^49,50. («Эндогенный ретровирус» означает присутствие последовательности сходных с ретровирусами геномов в человеческой ДНК, которые не превращаются в инфекционные частицы (следовательно термин неправильный). 8% человеческой ДНК состоит из таких последовательностей^49,50. «Производство эндогенного ретровируса в клеточной структуре может начаться спонтанно или может быть вызвано химическими реактивами или радиацией)⁵¹.

Никогда невозможно учесть каждый искажающий фактор в эксперименте, но как минимум способ контроля должен учитывать каждый известный фактор. Это включает в себя in vivo физиологическое состояние пациентов, от которых были получены предположительно инфицированные клетки и сыворотка, и in vitro условия, под которыми клетки культивировались, обрабатывались и содержались. Много научных публикаций говорят, что клетки, не зараженные ретровирусом, культивированные под теми же условиями, что и ≪зараженные клетки≫, производят один или более феноменов, про которые говорят, что они доказывают ретровирусную ≪изоляцию≫ ≪инфицированных≫ клеток. В 1976 году ретровирусолог Джордж Тодаро заявлял, что неудача в производстве похожих на ретровирус частиц в клеточных культурах «может отражать ограничения техник ко-культивации in vitro»⁵², таким образом, ограничения условий преобладали в частности в клеточных культурах в то время, когда проводился эксперимент. Перед эрой СПИДа Галло, Вайс и другие ученые опубликовали статьи, показывающие, что «экспрессия эндогенных ретровирусов может затрагивать результаты экспериментов по другим темам»^38,53.

Контроли, применяемые в исследовании ВИЧ должны быть клетками и сыворотками, полученными от похожих на пациентов со СПИДом, но у которых нет СПИДа и кто не принадлежит к группе риска по СПИДу. Похожесть должна включать в себя клинические, гематологические, биохимические, серологические (гипергаммаглобулинемия) и метаболические (клеточная оксидация) результаты, которые хорошо документированы у пациентов со СПИДом. Контрольные эксперименты должны выполняться параллельно с тестовыми экспериментами, причем как тестовые, так и контрольные эксперименты должны трактоваться одинаковым способом. Чтобы минимизировать предвзятость, экспериментатор не должен был знать, какая группа тестовая, а какая контрольная. Ни в одном из своих экспериментов Монтанье о таких данных не сообщал. Невыполнение твёрдых правил контроля и вообще любого контроля переполняет исследования ВИЧ. Первый «контроль» Монтанье состоял из культуры лимфоцитов от здорового человека, в которой RT-активность не определялась. Этот «контроль» был неправильным, потому что вне зависимости от воздействия предполагаемого вируса, эти клетки были в состоянии, не сравнимом с таковым у пациента со СПИДом.

Монтанье не доказал, что RT-активность была из-за ретровирусного энзима. Более того, он не доказал, что энзим обратно транскрибировал ретровирусную РНК или даже клеточную РНК. Он определил RT-активность, внедрив искусственную РНК в культуру, РНК, к которой был прицеплен короткий сегмент искусственной ДНК. Эта РНК-ДНК известна как шаблонный праймер и состоит из 100-200 повторов одной и той же рибонуклеидной последовательности (шаблон), заглушенной с одного конца одной последовательностью ДНК. Искусственный шаблонный праймер, повсеместно использованный Монтанье, это An.dT_12,15 [также известный как (aka((rA)n.(dT)_12,15) и An.dT₁₅. Этот шаблонный праймер транскрибируется не только обратной транскриптазой, но и клеточной ДНК-полимеразой. Монтанье знал, что в 1980 году имелось доказательство того, что «среди ряда шаблонных праймеров (rA)n.(dT)_12,18 наиболее часто использовался, поскольку обратная транскриптаза показывает высокую активность с этим шаблонным праймером. Однако клеточные ДНК полимеразы (полимераза β и полимераза γ) также эффективно используют этот же самый шаблонный праймер»⁵⁴. Фактически, в 1975 году одна из этих полимераз, ДНК-полимераза γ, была определена как клеточный энзим, который «копирует An.dT₁₅ с высокой эффективностью, но не очень хорошо копирует ДНК»⁵⁵. Последнее подтверждается в обзоре ДНК-полимеразы γ, опубликованным Лори Кагуни (Laurie Kaguni) из отдела биохимии и молекулярной биологии Мичиганского государственного университета в 2004 году⁵⁶. Более детальный обзор обратной транскрипции и обратных транскриптаз

З Д Е СЬ :http://theperthgroup.com/HIV/ReverseTranscriptasesFinal.pdf

Второй эксперимент Монтанье

Метод: Т-клетки BRU были ко-культивированы с Т-клетками здорового донора крови.

Результат: Определение активности обратной транскриптазы. Данные электронной микроскопии не опубликованы.

Интерпретация Монтанье: «Размножение» (передача) и «изоляция» ретровируса

Комментарий

Доказательство передачи требует введения очищенных, похожих на ретровирус частиц в неинфицированную клеточную культуру, за которыми следует появление частиц, морфологически и биохимически идентичных введенным и с отрицательным результатом в контрольной группе. Несмотря на то, что указывалось: «Образцы [надосадочной культуры] регулярно брались для… проверки на электронном микроскопе», Монтанье не опубликовал свидетельств присутствия похожих на вирус частиц в его ко-культуре. У Монтанье не было контроля. Второй контроль должен был состоять из лимфоцитов здорового донора, ко-культивированных с Т-лимфоцитами больного человека, как описано выше. Если даже RT-активность специфична для ретровируса, определение этой активности не может расцениваться как доказательство передачи. RT-активность может быть связана с клетками BRU, как это было в первом эксперименте. Доказательство передачи требует доказательства того, что RT-активность была вызвана Т-клетками здорового донора крови. В этом эксперименте не было такого свидетельства. И опять, даже если фермент специфичен для ретровируса, RT-активность это не изоляция ретровируса. Определение сердечных или печеночных ферментов в крови пациента не значит, что в лаборатории изолировали сердце или печень пациента.

Третий эксперимент Монтанье

Это иллюстрирует вторую крупную ошибку в построении “вируса СПИДа”, на этот раз с участием предполагаемых вирусных частиц. После провала выявить частицы в культуре из первых двух экспериментов супернатант (надосадочная жидкость), полученный из второго эксперимента, инкубировали лимфоцитами, полученными из пуповинной крови двух плацент.

Meтод: Супернатант от BRU + здоровые доноры крови Т-клеточной ко-культуры были добавлены к пуповинным Т-клеточным культурам.

Результат: Одна электронная микрофотография культуры, показывающая ретровирус-подобные частицы.

Интерпретация Монтанье: BRU инфицирован «типичным С-типом» ретровирусом.

Комментарий

Одна электронная микрофотография Монтанье из культуры лимфоцитов пуповины является единственным электронно-микроскопическим доказательством того, что клетки BRU были заражены ретровирусом⁵⁷, но это утверждение окружено многочисленными неопределенностями.

В 2010 году Барре-Синусси описала события, приведшие к микрофотографии:^32,41

...и затем [после нахождения RT-активности в культуре клеток] ...мы немедленно позвонили нашему парню, который отвечал за электронную микроскопию и сказали, пожалуйста, не могли бы вы посмотреть под микроскопом, можете ли вы увидеть частицу вируса, и если она похожа на ретровирус...а после, после, совсем, было очень сложно, потому что это было только несколько инфицированных клеток, так что это была очень сложная задача, для него, чтобы найти клетки, которые просто продуцировали эти частицы, но, наконец он нашел это, и он нашел один лимфоцит, с многообещающей частицей типичного ретровируса, и, очень близко от этой клетки одна полная зрелая частица, похожая на ретровирус. (В 2005 году электронный микроскопист Шарль Доге (Charles Dauguet) и соавтор Монтанье рассказал Джамелю Тахи, что его попросили изучить культуру клеток только после 15 дней неудачного поиска частиц в градиенте плотности “очищенного вирусного” материала⁵⁸).

Монтанье не имел контроля. Контроль для третьего эксперимента, третий контроль, должен состоять из добавления супернатанта от второго контрольного эксперимента (как определено выше) в пуповинную культуру лимфоцитов.

Культура, также как и градиент плотности очищенных супернатантов от теста и контроля должны были быть представлены для электронной микроскопии Доге, который должен был потратить то же время и усилия, изучая оба набора образцов. Что контроля не было подтвердил Доге, когда он его спросили смотрел ли он контрольные образцы: «Нет...я так не думаю. Образцы, с которыми я работал, были из зараженных культур».⁵⁸

Согласно определению, ретровирусы являются “оболочечными вирусами с диаметром 100-120 нм с шипами на клеточных мембранах. Выпущенные клетками вирионы [частицы, свободные от клеток] содержат конденсированные внутренние тела (ядра) и усваиваются проекциями (шипами, ручками)”.⁵⁹ Согласно их способу сборки и тонкой структуры, они делятся на подсемейства и роды. На сегодняшний день ни Монтанье, ни Галло не опубликовали электронной микрографии частиц, подтвердивших, что они “ВИЧ” и демонстрирующих все морфологические характеристики ретровирусных частиц.