Микробиота толстого кишечника

МИКРОБИОТА ТОЛСТОГО КИШЕЧНИКА

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ФЕКАЛЬНОЙ МИКРОБИОТЫ

Анатомия толстой кишки

Строение

В толстой кишке выделяют три отдела:

1. слепую кишку (лат. caecum) с червеобразным отростком ,

2. ободочную кишку (лат. colon) с четырьмя подотделами (восходящая ободочная, поперечная ободочная, нисходящая ободочная и сигмовидная кишки) и

3. прямую кишку (лат. rectum) с широкой частью — ампулой прямой кишки и оконечной сужающейся частью — заднепроходным каналом , заканчивающейся анальным отверстием.

Длина толстой кишки у взрослого человека в среднем 160 см, внутренний диаметр в среднем от 5 до 8 см и уменьшается в направлении от слепой к прямой кишке. Толщина стенки толстой кишки — 2–3 мм, при сокращении — 4–5 мм, толщина стенки прямой кишки — 2,4–8 мм.

Толстая кишка отделяется от тонкой илеоцекальным клапаном, который открывается и закрывается, пропуская содержимое кишечника только в одном направлении. Так же он является естественным барьером для микроорганизмов толстого кишечника.

В организме наблюдается «ЭТАЖНОСТЬ» расселения различных видов бактерий по вертикали: выше всего располагаются аэробы, ниже факультативные анаэробы и еще ниже – строгие анаэробы.

По мере продвижения содержимого по отделам кишечника (тонкого, толстого) снижается парциальное давление кислорода и повышается значение рН среды. Таким образом, хотя содержание бактерий во рту может быть достаточно высоким – до 106 КоЕ/мл, оно снижается до 0–10 КоЕ/мл в желудке, поднявшись на 101–103 КоЕ/мл в тощей кишке и 105–106 КоЕ/мл в дистальных отделах подвздошной кишки, с последующим резким возрастанием количества микробиоты в толстой кишке, достигая уровня 1012 КоЕ/мл (леток на 1 мл содержимого) в дистальных ее отделах.

Функционирование толстой кишки:

Из тонкой кишки через илеоцекальный клапан в толстую поступает 0,5-1 л, содержимого, которое подвергается воздействию бактерий, населяющих толстую кишку. Здесь всасывается основная масса воды, частично расщепляется растительная клетчатка; разрушаются многие вещества, в результате чего образуются токсические соединения, обезвреживающиеся в печени; происходит всасывание витаминов и аминокислот, вырабатываемых симбиотическими бактериями и формирование каловых масс, а также накапливание и удерживание их до выведения наружу.

За сутки при правильном питании взрослый человек выделяет 150 - 200 г кала. Кроме того, у здорового человека в течение суток образуется и выводится 300 - 350 см3 газа.

Микробиота толстой кишки

Микробиота толстого кишечника является самой многочисленной, составляет 60% всей микробиоты организма и представлена 17 семействами, 45 родами и более чем 1000 видов бактерий. Максимальное количество бактерий обнаруживается в слепой и поперечно-ободочной кишке. Такая высокая плотность бактериальных клеток в толстой кишке обусловлена медленным передвижением содержимого и отсутствия кислорода в этом сегменте. Количество микробов может достигать 1012 в 1 г фекалий, около 95% из них составляют анаэробы.

ВИДОВОЙ СОСТАВ

В видовой состав микробиоты толстой кишки входят анаэробных и аэробных микроорганизмов, а так же представители непатогенных простейших родов и около 10 кишечных вирусов. Таким образом, у здоровых лиц в толстом кишечнике насчитывается около 400 видов различных микроорганизмов, большую часть из которых составляют представители так называемой облигатной микрофлоры - бифидобактерии, лактобактерии, непатогенная кишечная палочка и др. На 92–95% микрофлора кишечника состоит из облигатных анаэробов.

1. Преобладающие бактерии. В связи с анаэробными условиями у здорового человека в составе нормальной микрофлоры в толстом кишечнике преобладают (92–95% ) анаэробные бактерии:

- грамотрицательные а палочки - бактероиды (особенно Bacteroides fragilis),

- анаэробные молочнокислые бактерии (например, грамположительные бифидобактерии, лактобациллы),

- грамположительные спорообразующие клостридии (Clostridium perfringens),

- грамположительные спорообразующие анаэробные палочки (клостридии перфрингенс и др.)

- анаэробные грамположительные кокки (пептострептококки, пептококки, Gemella morbillorum).

- грамположительные анаэробные палочки эубактерии,

- род грамположительных факультативно анаэробных бактерий – стрептококки 10⁵–10⁷ КОЕ/г,

- грамотрицательных анаэробных неспорообразующих бактерий фузобактерии (Fusobacterium) 10⁷–10¹⁰ КОЕ/г , продуцируют масляную кислоту. Некоторые виды фузобактерий являются условно-патогенными и при имуннодефицитах могут вызывать вторичные гангренозные и гнойно-гангренозные процессы.

- род грамотрицательных анаэробных неспороносных кокковидных бактерий - вейлонеллы (Veillonella) в 1г кала от 0 до 10⁸ КОЕ. Вейлонеллы входят в состав нормальной микрофлоры человека. Однако некоторые виды вейлонелл могут быть возбудителями раневых и гнойных инфекций.
2. Малую часть микрофлоры (от5 до 10%) составляют аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы:

- грамотрицательные колиформные бактерии (прежде всего кишечная палочка - E.Coli), энтерококки.

- грамотрицательные факультативно-анаэробные палочки (кишечные палочки и сходные с ними бактерии сем.

Enterobacteriaceae - цитробактер, энтеробактер, клебсиеллы, протей и др.);

3. В очень небольшом количестве: стафилококки, псевдомонады, синегнойная палочка, грибы рода Candida, отдельные виды спирохет, микобактерий, микоплазм, простейших и вирусов.

Следует отметить, что бифидобактерии, как наиболее строгие анаэробы колонизируют наиболее близкую к эпителию зону, где всегда поддерживается отрицательный окислительно-восстановительный потенциал (причём не только в толстой кишке, но и в других, более аэробных биотопах организма: в ротоглотке, влагалище, на кожных покровах).

ОСНОВНЫЕ Функции кишечной микробиоты:

Защитная
Пищеварительная
Метаболическая
Иммуномодулирующая
Синтезирующая
Регуляторная
Противоаллергическое
Детоксиционная.

1. Защитная функция, заключается в препятствии заселения посторонних микроорганизмов в кишечнике, которые могут вызвать различные инфекционные заболевания кишечника.

Бактерии стимулируют выработку слизи бокаловидными клетками; усиливают целостность эпителиального барьера.

2. Пищеварительная функция, бактерии флоры кишечника участвуют в расщеплении белков, жиров, углеводов, до аминокислот, жирных кислот и моносахаридов. Так же они усиливают перистальтику кишечника, препятствуя развития запоров.

3. Стимуляция иммунитета, за счёт бифидобактерий, стимулируют размножение и повышают активность иммунных клеток (Т- и В-лимфоцитов, макрофагов, моноцитов). Оказывают влияние на синтез интерферона (белка, который помогает бороться с вирусной инфекцией).

Именно микрофлора кишечного тракта (кишечный микробиом) принимает активное участие в созревании клеток иммунной системы, 70-80% из которых находятся в кишечнике

4. Синтезирующая функция, бактерии нормальной флоры кишечника участвуют в образовании витаминов (В, К, С), некоторых кислот, ферментов.

Выведение токсинов (детоксикационная функция), заключается в поглощении различных токсинов (фенолы, соединения тяжёлых металов и другие), бифидобактериями флоры кишечника.

5. Регуляторная функция, т.е. бактерии флоры, регулируют газовый состав кишечника, водно-солевой обмен, холестерина и другие.

6. Противоканцерогенное (противораковое) действие, заключается в поглощении бифидобактериями предшественников раковых клеток. Лактобактерии выделяют особые вещества, подавляющие развитие опухолевых клеток и направленно стимулируют иммунные клетки организма.

7. Противоаллергическое действие. Бифидобактерии тормозят превращение пищевого гистидина в гистамин (вещество, вызывающее развитие аллергических реакций).

8. Детоксицирующая — участвуют в удалении кишечных ядов (индол, скатол). Связывают токсичные химические соединения, обладающие канцерогенным действием.

ПРИЧИНЫ НАРУШЕНИЯ кишечной микробиоты:

· Антибиотики- обладают антимикробным действием, т.е. убивают бактерии, как чужеродные, так и полезные;

· Химиопрепараты, гормонотерапия, радиотерапия, воздействие радиации, так же приводят к снижению иммунитета, вследствие чего нарушается нормальная флора кишечника;

· Нерациональное питание, приводит к возможному развитию дисбактериоза, в тех случаях, если в рационе преобладают углеводы, белки животного происхождения и жиры и отсутствуют свежие овощи и фрукты. В этом случае происходят бродильные процессы в кишечнике, с последующим развитием гнилостной флоры.

· Острые или хронические кишечные инфекции, приводят к вытеснению нормальной флоры кишечника и размножению патогенной;

· Паразитарные заболевания кишечника (аскаридоз), выделяют вещества, которые уничтожают микробы нормальной флоры кишечника;

· Снижение иммунитета;

· Пожилой возраст, связаны со слабой иммунной системой и возрастными особенностями кишечной флоры.

Наилучшим, и в ряде случаев единственным, способом восстановления нормальной микрофлоры, лечением ОКИ является метод трансплантации фекальной микробиоты. Суть – введение пациенту орально, ректально или через зонд очищенных и отфильтрованных фекальных масс, полученных от здорового донора.

(ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ФЕКАЛЬНОЙ МИКРОБИОТЫ)

Фекальная трансплантация– не только помогает лечить инфекции, но и восстанавливает естественный баланс микроорганизмов в нашем теле, в противоположность антибиотикам.

ПРИЧИНЫ ПРИМЕНЕНИЯ ТФМ

1. Эта процедура решает многие проблемы, включая проблему резистентности некоторых патогенных микроорганизмов к антибиотикам.

2. У 5–25 % пациентов, принимающих антибиотики одно из осложнений — Анитибиотикоассоциированные диареи (ААД). Причиной ААД также могут быть клостридии диффициле (Clostridium difficile) — не примерно одна треть случаев а так же, сальмонелла (Salmonella spp.), Клостридии перфрингенс (Clostridium perfringens) тип А, стафилококк золотистый (Staphylococcus aureus), клебсиелла окситока (Klebsiella oxytoca), грибы рода кандида (candida) и другие микроорганизмы. Так количество Clostridium difficile в составе нормальной микрофлоры кишечника здорового взрослого человека не превышает 0,01–0,001 %. Однако при приеме антибиотиков последняя цифра может возрастать до 15–40 %.

3. При воспалительных заболеваниях кишечника является снижение разнообразия облигатных микроорганизмов, в том числе дефицит бактерий двух типов: Firmicutes и Bacteroidetes

• фирмикуты (лат. Firmicutes) – бактерии с толстой клеточной стенкой, грамположительные, к ним относятся палочковидные, кокковые формы бактерий, а также актиномицеты, коринебактерии и микобактерии;

• бактероиды (лат. Bacteroides) — род грамотрицательных анаэробных бактерий. Бактероиды — наиболее типичные нормальные обитатели кишечника человека, составляющие около половины всей его микрофлоры.В связи с трудностью анаэробного культивирования и, следовательно, с высокой стоимостью исследования бактероиды при анализах во многих лабораториях не определяются.

Воспалительные процессы в кишечнике провоцируют не только заболевания собственно ЖКТ, но аутоиммунные заболевания, например, рассеянный склероз, ревматоидный артрит, аутизм, а так же нарушение различных обменных процессов. Аллергическом дерматите.

Например, изучение бактерии (Фэцалибактериум) Faecalibacterium prausnitzii (вид грамположительных анаэробных бактерий, составляющих в норме около 5% от всего числа бактерий толстого кишечника человека) позволило существенно продвинуться в лечении болезней кишечника. Оказалось, что это основная бактерия, которая вырабатывает масляную кислоту в толстой кишке. Масляная кислота контролирует нормальное развитие клеток и предотвращает развития различных заболеваний кишечника. При ряде заболеваний способна предотвратить разрушение стенки кишечника. (предотвращает)

4. Важнейшим из этих факторов Аллергического дерматита, особенно у детей, является нарушение микробиоты кишечника. У 80–95% больных отмечается дисбиоз кишечника.

5. ТФМ является более эффективной, чем применение пробиотиков в восстановлении измененной микробиоты кишечника, так как последние не способны колонизировать кишечник на длительный период.

4. ТФМ позволяет заселить кишечник разнообразной микробиотой и в самые короткие сроки восстановить состав и популяционные взаимодействия микроорганизмов.

История фекальной трансплантации .

Впервые случай фекальной трансплантации был описан в IV столетии нашей эры в Древнем Китае. В то время китайские врачи сообщали о применении чужих фекалий для лечения пищевых отравлений и диареи.

Намного позже, в XVI веке, авторитетный китайский фитотерапевт Ли Ши-чжэнь сообщал об эффективном лечении «болезней живота» с использованием «желтого супа» и «золотого сиропа», которые содержали свежие, сушеные или ферментированные фекалии.

В XVI веке в ветеринарной медицине существовала так называемая трансфаунация – процесс передачи микроорганизмов из пищеварительной системы здорового животного в пищеварительный тракт больного. Кстати, этот метод используется до сих пор.

Во время Второй мировой войны немецкие солдаты в Северной Африке сообщали, что бедуины в качестве лекарства от дизентерии использовали свежий верблюжий навоз, который у них считался очень эффективным средством.

Использование фекального материала для лечения болезней является очень древним методом, который, как считают некоторые ученые, применялся еще в доисторическую эпоху, просто подтверждений этого не осталось. Формально история фекальной трансплантации насчитывает уже более 1600 лет.

В 1957 году американский ученый Айсман c коллегами использовал этот метод для борьбы с клостридиальной инфекцией. Успешный опыт использования пересадки микробиоты распространился по всему миру. Сегодня его успешно применяют в Австралии, США, Германии, Великобритании и других странах. Начали применять в России.

Для реализации ТФК донор должнен быть инфекционно безопасным для реципиента, не иметь сопутствующей патологии желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) и онкологических заболеваний. С другой стороны, обладать разнообразной микробиотой без наличия в стуле патогенных микроорганизмов.

И получение данного ответа было сопряжено с рядом трудностей.

При традиционном культуральном методе,изучениебиологических свойств бактерий возможно только при наличии чистой культуры.

Он не эффективен в обнаружении анаэробных микроорганизмов: в связи с трудностью анаэробного культивирования и, следовательно, с высокой стоимостью исследования бактероиды при анализах во многих лабораториях не определяются.

Так же эти методы не позволяют анализировать особенности популяционных взаимодействий микроорганизмов.

В итоге, при традиционном анализе на дисбактериоз (культуральный метод) мы можем увидеть меньше 10% бактерий!

Метод ценен для определения условно-патогенной микрофлоры,определения чувствительности к антибиотикам.

Культуральный (или бактериологический) метод - совокупность методик искусственного выведения и идентификации чистых культур микроорганизмов на питательных средах в целях их идентификации. Современные методы изучения большинства биологических свойств бактерий возможны только при наличии чистой культуры.

Чистая культура - совокупность микроорганизмов одного вида. Чаще всего чистую культуру получают путем отбора и культивирования изолированной колонии (потомство одной микробной клетки).

При бактериологическом методе исследования кала – производят посев исследуемого материала на питательные среды, выращивают, получают изолированные колонии, выбирают 2-3 колонии для исследования. Делают заключение о видовой принадлежности выделенной культуры и ее свойствах.

Только с появлением методов расшифровки и анализа ДНК, ученые обнаружили, что микробиота (т.е. нормальная микрофлора) человека в сотни раз богаче - в кишечнике есть больше тысячи разных видов бактерий, хотя раньше было известно всего несколько десятков.

В 2008 г. был запущен глобальный проект «Микробиом человека»; (НМР), ставивший своей целью расшифровку генома бактерий, населяющих организм человека. Генетическим материал ДНК и РНК представляют собой уникальную «визитную карточку» каждого конкретного организма.

Так, по данным геномного анализа кишечной микрофлоры, было выявлено 3 300 000 генов, принадлежащих бактериям (по сравнению с 23 000 генов, присутствующих во всех клетках тканей организма).

К ведущим методам, которые позволяют идентифицировать новые виды микроорганизмов и определять видовой состав исследуемого материала относятся методы:

1. Секвенирования(от лат. sequentum — последовательность) и разновидности этого метода. Его сущность - определение нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК или РНК, что помогает расшифровывать новые геномы и идентифицировать новые виды микроорганизмов. Метод позволяет за один запуск прибора определить практически весь видовой состав, населяющий то или иное местообитание.

Наиболее распространенный способ анализа видового разнообразия бактерий основан на секвенировании гена 16S рРНК. Этот ген содержит видоспецифические участки, которые можно использовать для видовой идентификации бактерий. Ген присутствует в геноме всех бактерий, но отсутствует у вирусов и эукариот.

За разработку метода секвенирования в 1980г. авторами была получена Нобелевская премия. На его основе в наше время появляются новые все более совершенные методики.

Преимущества метода секвенирования микробиоценоза:

• Скорость выполнения, относительная дешевизна.
• Методологическая простота.
• Отсутствие необходимости выделения чистой культуры.
• Применим как к культивируемым, так и некультивируемым бактериям.
• Определение качественного и количественного соотношения родов, отдельных видов микроорганизмов в составе микробиоценоза.
• Внутривидовое сходство сиквенса 98-99% позволяет идентифицировать бактерии с высокой точностью

2. Методика ПЦР (полимеразной цепной реакции) – дает возможность идентифицировать вид микроорганизма только когда уже известна последовательность его генетического кода. Его точность приближается к 100% в области диагностирования не только инфекционных болезней, но так же вирусов, наследственных патологий. При этом возможно обнаружение даже единичного вредоносного микробав минимальной пробе из нескольких молекул. Болезни можно диагностировать в любой стадии (острой или хронической), а также — на раннем этапе — до очевидных проявлений болезни путем идентификации возбудителей, на основе их ДНК, РНК. В процессе ПЦР происходит многократное удвоение фрагмента ДНК и РНК для получения необходимого количества материала для исследования и идентификации. Метод разработал американский ученый К. Мюллис, в 1983 получивший Нобелевскую премию. Но на тот момент он был не совершенен. И только в середине 90х годов начала распространяться. В настоящее время процесс полностью автоматизирован и результат ПЦР можно получить через несколько часов после начала исследования.

! Метод ПЦР дает возможность идентифицировать вид микроорганизма только когда уже известна последовательность его генетического кода настолько хорошо, чтобы подобрать специальные инструменты для его увеличения и индентификации!

Реализация названных технологий, прежде всего секвенирования, позволяет: