Основные биохимические тесты идентификации М. Tuberculosis

10. Подтверждение принадлежности, выделенной культуры микобактерий к комплексу М. tuberculosis на основании специальных лабораторных тестов, является обязательным.
11. Первичная идентификация микобактерий комплекса М. tuberculosis от нетуберкулезных микобактерий осуществляется по следующим культуральным характеристикам: скорость роста на плотных питательных средах; пигментообразование; морфология колоний; наличие кислотоустойчивости; температура роста. Для дифференциации микобактерий комплекса М. tuberculosis, к которому относятся следующие виды микобактерий: М. tuberculosis, М. bovis, M. africanum, M. Microti, от медленнорастущих нетуберкулезных кислотоустойчивых микобактерий применяются следующие основные биохимические тесты:
тест на наличие способности продуцировать никотиновую кислоту (ниациновый тест);
тест на наличие нитратредуктазной активности;
тест на наличие термостабильной каталазы;
тест на наличие роста на среде с натрием салициловокислым (1 мг/мл) (или рост на среде, содержащей 500 мкг/мл паранитробензойной кислоты; рост на среде, содержащей 5% хлорида натрия).
12. Для дифференциации М. tuberculosis и М. bovis учитываются результаты следующих проб:
ниациновый тест;
тест на наличие нитратредуктазы;
тест на наличие пиразинамидазы;
определение видовой принадлежности молекулярно-генетическим исследованием (Geno Type MTB® DR).
13. Для определения лекарственной устойчивости МБТ к противотуберкулезным препаратам первого и второго ряда применяют метод пропорций на среде Левенштейна-Йенсена (далее – Л-Й).
14. Устойчивость тестируемых штаммов определяется отношением числа колоний, выросших на среде с лекарствами к числу колоний, выросших на среде без лекарств. Этот показатель позволяет узнать процент устойчивых мутантов в общей популяции жизнеспособных колониеобразующих единиц.
15. Критические концентрации лекарственных препаратов в среде Л-Й:
Изониазид - 0,2 мкг/мл; Стрептомицин - 4,0 мкг/мл; Рифампицин - 40 мкг/мл; Этамбутол - 2,0 мкг/мл; Офлоксацин - 2 мкг/мл; Амикацин - 20 мкг/мл; Капреомицин - 20мкг/мл; Этионамид - 20 мкг/мл; Циклосерин - 20 мкг/мл; ПАСК - 1,0 мкг/мл; Канамицин - 20 мкг/мл.
16. При приготовлении среды с препаратами учитывается активность препарата, которая может варьировать от одной партии/серии лекарств к другой, в зависимости от его производителя. Эти сведения приводятся на этикетках контейнеров, упаковках или предоставляются производителем.
17. Пробирки в термостате хранят в наклонном положении с неплотно прикрытыми крышками при температуре 370 ^оC, до появления видимого роста на среде без лекарств, затем в течение 4-6 недель с закупоренными пробками.
18. Интерпретация результатов. Критерием устойчивости является 1,0% роста бактериальной популяции для всех препаратов. Через 4 недели инкубации рост на среде, не содержащей лекарства, инокулированной из суспензии 10^-4, сравнивают с ростом на среде с препаратом, инокулированным из суспензии 10^-2. Если число колоний больше на среде, содержащей лекарство (равен или превышает 1%), тестируемый штамм считается устойчивым.

Приложение 18
к Инструкции по организации
и осуществлению профилактических
мероприятий по туберкулезу

Проведение культуральной диагностики туберкулеза на
автоматизированной системе BАСТЕС MGIT – 960 с использованием
жидких сред в лабораториях ПТО

1. Культуральная диагностика туберкулеза с использованием жидких сред осуществляется на автоматизированной системе BАСТЕС MGIT – 960. В случае роста МБТ (до уровня 105-106 КОЕ на 1 мл среды) прибор оценивает пробу как положительную и подает световой и/или звуковой сигнал. При отсутствии роста в течение шести недель (42 дня) прибор оценивает пробу как отрицательную.
2. Посевы на жидкие среды выполняются в ламинарном боксе II класса защиты. Пробирки перед работой маркируют, обращая внимание на то, чтобы маркировочная запись не попала на штрих-код пробирок.
3. При обнаружении изменений в питательной среде в отрицательных пробирках, готовят мазки для микроскопического исследования и проводят посев материала на кровяной агар (для контроля контаминации) и на среду Л-Й.
4. Для подтверждения положительных результатов из каждой пробирки MGIT готовят мазки, которые окрашивают по Циль-Нильсену в соответствии с общими рекомендациями. Кислотоустойчивые колонии в виде «кос» подтверждают наличие микобактерий туберкулеза. При обнаружении отдельных кислотоустойчивых бактериальных клеток проводится идентификация культуры.
5. Если в пробирке, идентифицируемой аппаратом как «положительная», при микроскопии отмечается отрицательный результат, а сама среда при визуальной оценке прозрачная и нет подозрения на контаминацию, пробирку необходимо поместить обратно в систему на 3 дополнительных дня. После этого повторяют микроскопию мазков. При повторном отрицательном результате микроскопии, отсутствии визуальных признаков роста и контаминации пробы (отрицательный рост на кровяном агаре), а также отсутствии признаков роста на среде Л-Й в течение 10 недель, пробу считают отрицательной.
6. Допустимый уровень контаминации для плотных питательных сред 3-5%, для жидких питательных сред – 7-8%.
7. Для идентификации видов микобактерий используются следующие критерии:
1) интенсивность роста: M.tuberculosis, M. bovis и, в определенной степени, M.kansasii растут медленно по сравнению с нетуберкулезными микобактериями;
2) при росте в жидкой среде МБТ принимают грануловидную форму, большинство нетуберкулезных микобактерий чаще образуют легкую однообразную замутненность среды (кроме M. kansasii);
3) в мазке, сделанном из положительного бульона MGIТ, микобактерии туберкулезного комплекса образуют ярко выраженные сгустки и змеевидные нити (корд-фактор), тогда как нетуберкулезные бактерии образуют разрозненные небольшие сгустки и нити, либо единичные клетки.
8. Постановка ТЛЧ:
1) ТЛЧ к противотуберкулезным препаратам первого и второго ряда на аппарате BАСТЕС MGIT – 960 проводятся на основе метода пропорций. Для ТЛЧ используются более низкие концентрации чистых субстанций ПТП, чем на плотных средах (во избежание ложных результатов чувствительности): стрептомицин – 1,0 мкг/мл; изониазид – 0,1 мкг/мл; рифампицин – 1,0 мкг/мл; этамбутол – 5,0 мкг/мл;
2) засеянные пробирки ставят в специальные держатели для постановки лекарственной чувствительности в строгой последовательности: контроль, стрептомицин, изониазид, рифампицин, этамбутол.
9. Учет результатов: по завершении теста (14-21 день) на приборе появляется сообщение о готовности результатов. Для их получения сканируют штрих-код держателя и распечатывают отчет, в котором указаны результаты ТЛЧ к каждому лекарственному препарату: чувствительный (S); резистентный (R), результат теста не определен или ошибка (X).
Прибор интерпретирует результаты, когда единица роста (GU) в контроле роста достигает значения 400 (в течение 4-13 дней). Показатели единицы роста флакона с лекарственным препаратом оцениваются:
S – единица роста пробирки с лекарственным препаратом составляет не менее 100;
R – единица роста пробирки с лекарственным препаратом составляет 100 и более;
Х – неясные результаты, получаемые при определенных обстоятельствах, которые влияют на процедуру теста (например, при достижении единицей роста контрольного образца величины > 400 менее чем за 4 дня). В таком случае тест необходимо повторить с чистой, активно растущей культурой, которая подтверждена как комплекс M. tuberculosis.
Некоторые лекарственно-устойчивые штаммы растут в среде очень медленно, и со стандартным инокулятом результаты могут быть не достигнуты в течение 13 дней. В таком случае необходимо повторить исследование.
Отчетность: результаты исследования на лекарственную чувствительность передаются в клинические подразделения сразу по мере их готовности. Результат указывается как «чувствительный» или «резистентный» с названием используемого метода, типа лекарственного препарата и его концентрации.
10. Тесты на чувствительность к пиразинамиду:
ТЛЧ к пиразинамиду требует соблюдения особых условий к уровню рН среды (in vitro пиразинамид активен только в кислой среде) и для аппарата BАСТЕС MGIT - 960 разработан тест, в котором рН среды не превышает 6,0; концентрация пиразинамида для компенсации рН увеличена до 100 мкг/ мл;
11. ТЛЧ к препаратам второго ряда.
Готовые наборы для ТЛЧ к препаратам второго ряда отсутствуют.
Реагенты: проводится расчет критических концентраций субстанции ПТП второго ряда. Препараты, полученные после разведения дистиллированной водой или соответствующим растворителем, с помощью автоматической пипетки добавляют по 0,1мл (100 мкл) в промаркированные пробирки MGIT. Подготовка культуры для ТЛЧ и сам тест проводится аналогично вышеописанным процедурам постановки к ПТП первого ряда.
Концентрации ПТП второго ряда: амикацин – 1,0 мкг/мл; капреомицин – 2,5 мкг/мл; офлоксацин – 2,0 мкг/мл; этионамид – 5,0 мкг/мл.
При расчете учитывается количество активного вещества в 1 г субстанции:
1) первичное разведение офлоксацина и этионамида проводится диметилсульфоксидом (DMSO).
2) препараты для хранения дозируются объемом не менее 0,5 мл (3-4 ТЛЧ) с учетом потери при хранении.

Приложение 19
к Инструкции по организации
и осуществлению профилактических
мероприятий по туберкулезу

Проведение молекулярно-генетических методов диагностики
туберкулеза и определения лекарственной чувствительности
(GenoType ® MTBDR и Xpert MTB/RIF)

1. Устойчивость к рифампицину закодирована в единственном гене rpoB, отвечающим за активность РНК, устойчивость к изониазиду контролируется мутациями сразу в четырех генах – katG, inhA, ahpC и oxyR, используется набор GenoType ® MTBDR plus- тест.
2. Идентификация устойчивости к рифампицину проводится на основании выявления мутаций в гене rpoB (кодирующем бета-субъединицу РНК полимеразы). Идентификация высокого уровня устойчивости к изониазиду проводится на основании выявления мутаций в гене katG (кодирующем выработку каталазы-пероксидазы), тогда как низкий уровень устойчивости к этому препарату выявляется на основании выявления мутаций в регионе промотора гена inhA (кодирующего NADH-Enoyl-АТФ-редуктазу).
3. Набор GenoType ® MTBDR sl-тест позволяет в течение 2-х дней выявлять мутации в генах МБТ, ответственных за устойчивость к аминогликозидам и фторхинолонам, т.е. выявлять у больных наличие ШЛУ ТБ задолго до получения результатов бактериологического анализа.