ТЕМА 3. микроскопический метод исследования: морфология и структура бактерий. Сложные методы окраски

У бактерий различают микрокапсулу, капсулу и слизистый слой. Микрокапсула выявляется при электронной микроскопии в виде коротких мукополисахаридных фибрилл. Капсула представляет собой слизистый слой, который обычно сохраняет связь с клеточной стенкой. Капсула служит внешним покровом бактерий, толщина её более 0,2 мкм, она чётко обнаруживается под микроскопом после негативного окрашивания. Например, по методу Бурри – Гинса. Капсулы, в связи с их гелеобразной консистенцией, плохо удерживают красители, поэтому для их обнаружения наиболее приемлем метод негативного контрастирования. По химическому составу различают капсулы, состоящие из полисахаридов, содержащих азот (аминосахара); капсулы полипептидной природы.

Некоторые виды патогенных бактерий (S. pneumoniae, B. anthracis, C. perfringens и др.) образуют капсулы лишь в организме человека или животного, другие – как в организме, так и на искусственных питательных (иногда специальных) средах (S. aureus, S. Pyogenes, K. pneumoniae, K. rhinoscleromaris и др.). У патогенных бактерий капсула может окружать одну, две или целую цепочку клеток. Капсулы образуют мощную оболочку бактерий, предохраняют их от высыхания, несут для них запасные питательные вещества. Капсульные антигены патогенных бактерий определяют их антигенную специфичность и иммуногенные свойства. Нередко слизистые экзополимеры выделяются бактериальной клеткой в значительно большем количестве, частично отделяются от неё и образуют рыхлый слизистый слой.

В цитоплазме бактерий могут содержаться включения – компактные скопления химических веществ в форме видимых в световой микроскоп гранул. Представляют собой запасные питательные вещества или продукты обмена (волютин, гликоген, крахмал, жиры, сера, железо и др.). Присутствуют непостоянно. Имеют значение в идентификации. Выявляются специальными методами окраски анилиновыми красителями.

Бактерии имеют органоиды движения – жгутики. Это тонкие длинные нитевидные белковые образовании диаметром 12 – 30 нм и длиной от 6 – 9 до 80 мкм. Белок, из которого построены жгутики, называется флагеллин. Он обладает сократительной способностью.

Жгутик состоит из однотипных спиралевидных или продольно уложенных вокруг полой сердцевины белковых субъединиц, образующих цилиндрическую структуру, которая особым образом прикреплена к бактериальной клетке. По характеру расположения жгутиков и их количеству подвижные бактерии условно делят на 4 группы:

1) монотрихи – один полярно расположенный жгутик (V. cholerae);

2) лофотрихи – пучок жгутиков на одном конце (Pseudomonas methanica);

3) амфитрихи – по одному жгутику или пучки жгутиков на обоих концах клетки (Spirillum volutans);

4) перитрихи – множество жгутиков, расположенных вокруг клетки (E. coli, Salmonella typhi).

Жгутики выявляются прямым путем с помощью специальной окраски (с использованием протравы, которая вызывает набухание жгутиков) или косвенно по движению в капле суспензии, регистрируемому в темнопольном, фазово – контрастном и световом микроскопах, по диффузному помутнению полужидких сред или серологически.

На поверхности некоторых бактерий располагаются нежные реснички. Это небольшие трубочки, по внешнему виду напоминающие жгутики, но в отличие от них тоньше, короче, имеют канал. Встречаются у грамотрицательных бактерий. Различают: половые секс – пили и общие – фимбрии. Секс – пили – нитевидные структуры белковой природы (длина 0,5 – 10 мкм), которые образуются под контролем F – фактора (F – пили) или Col – фактора (i – пили). Возникают на поверхности бактерий в процессе конъюнкции и выполняют функцию органеллы, через которую ДНК переходит от донора к реципиенту. Количество плазмид (1 – 2 на клетку). Они отличаются антигенной специфичностью, наличием терминальных вздутий, способностью у адсорбции фагов, причём на i – пили – i – подобные фаги.

Фимбрии – трубчатые образования, исходящие из цитоплазмы. Их синтез контролируется бактериальной хромосомой. Общий диаметр фимбрий равен 3 – 25 нм, внутренний диаметр канала – около 2 нм. Одна бактерия может содержать сотни фимбрий, расположенных или на боковых поверхностях бактерии, например, у кишечной палочки, или на полюсах, например, у псевдомонад. Фимбрии принимают участие в слипании бактерий в агломераты, в их прилипании к различным поверхностям, в питании, поддержании осмотического давления. Выявляют агглютинацией эритроцитов и иммунными реакциями. Могут быть обнаружены лишь при электронной микроскопии.

Некоторые бактерии при неблагоприятных для существования условиях образуют защитные формы – споры. Спорообразование характерно для бактерий родов Bacillus, Clostridium, Sporosarcina, Sporolactobacillus, Desulfatomaculum и актиномицетов рода Thermoactinomyces. Спора, образующая внутри цитоплазмы бактериальной клетки, может иметь округлую или овальную форму. Она может располагаться в центре (центральное расположение у С.perfringens), на конце (терминальное расположение у C. tetani) или ближе к одному из концов (субтерминальное расположение у C. botulinum). Спора отличается от вегетативной формы репрессией генома, почти полным отсутствием обмена веществ, малым количеством свободной воды в цитоплазме, повышением в ней концентрации ионов кальция и появлением дипиколиновой кислоты, с которыми связывают термоустойчивость споры. образованием дополнительных оболочек, препятствующих осуществлению

ЗАДАНИЕ

1. Приготовить препарат по методу Бурри – Гинса и микроскопировать его.

Выявление капсул по методу Бурри – Гинса

а) на край предметного стекла нанести каплю туши, а рядом каплю исследуемой культуры. Капли быстро перемешать и с помощью шлифованного стекла приготовить тонкий мазок;

б) после высушивания мазок фиксировать над пламенем и окрасить фуксином в течение 1 – 2 минут;

в) осторожно промыть водой и высушить.

Бактерии окрашиваются в красный цвет, капсула не окрашивается и имеет вид светлой зоны вокруг бактерий на тёмном фоне.

2. Окраска включений волютина по методу Нейссера

Приготовить мазок и окрасить по методу Нейссера для выявления зёрен волютина, микроскопировать.

а) фиксированный мазок окрасить в течение 2 – 3 минут уксуснокислой синькой Нейссера;

б) препарат 10 – 30 секунд обрабатывать раствором Люголя;

в) не промывая водой, мазок докрасить в течение 30 – 60 секунд везувином.

Зёрна волютина окрашиваются в синий цвет, тела клеток – в жёлтый.

3. Микроскопировать препарат, приготовленный по методу Леффлера.

Окраска жгутиков по методу Леффлера

а) приготовить мазок из 18 – 24 – часовой культуры, для чего взвесь бактерий внести в каплю стерильной водопроводной воды, нанесенной на предметное стекло и высушить;

б) мазок обработать в течение 15 – 20 минут протравой, содержащей 1 мл насыщенного спиртового раствора фуксина, 10 мл 25 % водного раствора танина и 5 мл насыщенного водного раствора сернокислого железа;

в) мазок тщательно промыть водой, высушить на воздухе и докрасить фуксином Циля в течение 3 – 4 минут при легком подогревании;

г) препарат промыть водой и высушить.

4. Приготовить мазок из спороносной культуры способом Ожешки, окрасить по Цилю – Нильсену и микроскопировать.

Выявление спор способом Ожешки

а) приготовить мазок на краю предметного стекла;

б) нефиксированный мазок подвергнуть протравливанию кислотой при повышенной температуре, для чего на мазок налить 1 % раствор соляной кислоты и подогреть над пламенем горелки в течение 2 – 3 минут;

в) кислоту слить, препарат промыть водой, просушить и фиксировать над пламенем.

При такой обработке оболочка споры размягчается и становится доступной для красителя. Далее мазок окрасить по методу Циля – Нильсена:

а) на мазок поместить кусочек фильтровальной бумаги, на него налить карболовый фуксин Циля и подогреть стекло над пламенем горелки до появления паров;

б) охладить, снять бумагу, промыть водой и обесцветить 5 % серной кислотой в течение 30 секунд;

в) препарат тщательно промыть водой и докрасить раствором метиленового синего в течение 3 – 5 минут;

г) препарат промыть водой и высушить.

Карболовая кислота разрыхляет оболочку споры и тем самым повышает её тинкториальные свойства, а высокая концентрация красителя и нагревание в процессе окраски усиливают реакцию взаимодействия бактериальных спор с красителями. Споры окрашиваются в красный цвет. При обработке препарата серной кислотой вегетативные тела бактерий обесцвечиваются метиленовым синим.

Контрольные вопросы

1. Какова роль капсулы в жизнедеятельности бактериальной клетки?

2. Каков химический состав капсул и микрокапсул?

3. Какими методами выявляется капсула бактерий?

4. Каковы основные функции включений?

5. Как обнаружить наличие зёрен волютина у бактерий?

6. Какова структура, химический состав и функции жгутиков бактериальной клетки?

7. Каков принцип выявления жгутиков?

8. Каковы особенности строения пилей, фимбрий?

9. Какую роль играют споры бактерий?

10. Каковы особенности структуры и химического состава бактериальных спор?

11. В чём состоит процесс спорообразования у бактерий?