Тема 2.1. ИЗУЧЕНИЕ МОРФОЛОГИИ БАКТЕРИЙ И ИХ ТИНКТОРИАЛЬНЫХ СВОЙСТВ. ПРОСТЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ

План

Программа

Морфология бактерий и методы ее изучения.

Подвижность бактерий и методы ее изучения.

Простые методы окраски препаратов.

Определение размеров бактерий.

Демонстрация

Приготовление мазков из бактериальных культур.

Красители, используемые в микробиологии.

Подвижность бактерий в препарате "висячая" капля.

Задание студентам

Микроскопировать и зарисовать готовые мазки, окра­шенные простым методом (стафилококки, стрептококки, сарцины, палочки, стрептобациллы).

Приготовить мазки из бактерий, выращенных на жид­кой и плотной питательных средах.

Окрасить мазки простым методом.

Микроскопировать и дифференцировать бактерии в мазках по основным морфологическим признакам и зарисовать их. 5. Определить размеры бактериальной клетки.

Методические указания

Приготовление препаратов для микроскопического исследова­ния. Для приготовления препарата исследуемый материал берут из пробирки, колбы или чашки Петри бактериологической петлей или стерильной пипеткой. В некоторых случаях исполь­зуют препаровальные иглы.

Петлю прокаливают в пламени горелки для уничтожения посторонних бактерий. Вращательным движением вынимают из пробирки ватную пробку, прижимая ее V и IV пальцами к ладони, и обжигают край пробирки. Осторожно вводят петлю в пробирку, охлаждая ее о внутреннюю поверхность стекла, после чего легким скользящим движением захватывают мате­риал. Затем вынимают петлю из пробирки, снова обжигают край пробирки и закрывают пробкой. После приготовления препарата петлю обязательно прожигают (стерилизуют) в пла­мени. Жидкий материал из пробирки или колбы можно наби­рать пипеткой.

Приготовление нативных препаратов для прижизненного изу­чения микроорганизмов. Метод "висячей" капли. Пре­парат готовят на покровном стекле, в центр которого наносят одну каплю исследуемого материала. Затем предметное стекло с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки. Быстрым движением переворачивают препарат покровным стеклом вверх. В правильно приготовленном пре­парате капля должна свободно висеть над лункой, не касаясь ее дна или края. Для микроскопии вначале используют объек­тив малого увеличения (8х или 10х), находят край капли, а затем устанавливают объектив 40х или иммерсионный и ис­следуют препарат. Определяют подвижность бактерий.

Метод "раздавленной" к а пли. На поверхность обез­жиренного предметного стекла наносят каплю исследуемого материала или суспензию бактерий и покрывают ее покровным стеклом. Капля должна быть небольшой, не выходящей за край покровного стекла.

Прижизненная (витальная) окраска. Взвесь мик­роорганизмов вносят в каплю 0,001 % раствора метиленового синего или нейтрального красного. Затем готовят препарат "висячая" или "раздавленная" капля и микроскопируют.

После микроскопии препараты "раздавленной" или "вися­чей" капли опускают в дезинфицирующий раствор.

Приготовление фиксированных препаратов-мазков. Для при­готовления препарата на обезжиренное предметное стекло на­носят суспензию (взвесь) бактерий. Если мазок готовят из

жидкой питательной среды, то материал непосредственно на­носят петлей на предметное стекло и распределяют его так, чтобы получить тонкий мазок. В других случаях первоначально на предметное стекло наносят каплю воды или изотонического раствора хлорида натрия, в которую петлей вносят исследуе­мый материал и готовят взвесь. При правильном распределе­нии материала в мазке при микроскопии видны изолирован­ные бактериальные клетки. Мазки высушивают на воздухе или в струе теплого воздуха над пламенем горелки, не давая капле закипать.

Фиксация препарата. Высушенные мазки подвергают термической или химической обработке, в результате которой бактерии погибают и плотно прикрепляются к поверхности стекла. Обычно для фиксации мазка предметное стекло про­водят несколько раз через пламя горелки (мазком вверх).

Мазки крови, мазки-отпечатки из органов фиксируют по­гружением на 5-20 мин в метиловый или этиловый спирт или другие фиксирующие жидкости.

Окраска препаратов простым методом. Фиксированный мазок окрасить каким-либо одним красителем, например фук­сином водным (1-2 мин) или метиленовым синим (3-5 мин), промыть водой, высушить и микроскопировать.

Приготовление и окраска препаратов для люминесцентной микроскопии. Для люминесцентной микроскопии на предмет­ных стеклах готовят фиксированные препараты-мазки или на-тивные препараты, которые окрашивают специальными флю­оресцентными красителями: акридиновым желтым, акридино­вым оранжевым, ауромином, корифосфином. При работе с иммерсионным объективом используют нефлюоресцирующее масло.

Приготовление препаратов для электронной микроскопии. Приготовление препаратов для исследования в электронном микроскопе имеет ряд особенностей. Препараты готовят на специальных пленках-подложках, так как стекло непроницае­мо для электронов. Исследуемый объект максимально очища­ют от посторонних примесей и наносят на пленку-подложку, предварительно помещенную на опорную металлическую се­точку. Для контрастирования применяют соединения тяжелых металлов (золото, осмий, рутений и др.).

Измерение микробных клеток. Измерение микробов осущест­вляют в ходе микроскопического исследования с помощью специальных приспособлений. Для измерения применяют оку­ляр-микрометр и объект-микрометр. Окуляр-микрометр слу­жит для непосредственного измерения объекта и представляет собой стеклянную пластинку в окуляре, в центральной части которой нанесена шкала с 50 делениями. Объект-микрометр представляет собой стекло, в середине которого имеется эта­лонная шкала, разделенная на 100 частей. Цена деления шкалы

Форма Разме- Окраска Наличие Кислого- Под-клеток ры по мето- устойчи- виж-ду Грама СПОР кап" зерен вость ность сул волю-тина

Спорообразующие бактерии (окраска по методу Шеффера—Фултона).

Зерна волютина в клетках Corynebacterium diphtheriae (окраска по методу Нейссера).

Задание студентам

Микроскопировать и дифференцировать бактерии по морфологическим и тинкториальным свойствам в го­товом препарате из смеси бактерий (окраска по методу
Грама). Зарисовать.

Самостоятельно приготовить мазки из смеси бакте­рий, окрасить по методу Грама, Микроскопировать и дифференцировать бактерии по морфологическим признакам и тинкториальным свойствам. Зарисовать.

Микроскопировать и зарисовать:

капсулы (окраска по методу Бурри—Гинса);

С.diphtheriae, содержащие зерна волютина (окраска по методу Нейссера);

кислотоустойчивые бактерии М. tuberculosis (окраска по методу Циля—Нильсена);

спорообразующие бактерии (окраска по методу Шеффера—Фултона).

4. Сделать заключение по результатам проведенных исследований.

Методические указания

Сложные методы окраски. Сложные методы окраски исполь­зуют для выявления ультраструктурных компонентов бактери­альных клеток, имеющих достаточно большие размеры (мак­рокапсулы, жгутики, цитоплазматические включения и т.д.), а также для дифференцировки (различения) бактерий в зависи­мости от химического состава и особенностей их тонкой орга­низации (ультраструктуры).

Окраска по методу Грама

На фиксированный мазок нанести карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового через полоску фильт­ровальной бумаги. Через 1—2 мин ее снять, а краситель
слить.

Нанести раствор Люголя на 1-2 мин.

Обесцветить этиловым спиртом в течение 30-60 с до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.

Промыть водой.

Докрасить водным раствором фуксина в течение 1-2 мин, промыть водой, высушить и Микроскопировать.

Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фио­летовый цвет, грамотрицательные — в красный (рис. 2.2.1; на вклейке). В основе этого метода лежит избирательное обесцве­чивание — удаление комплекса генцианового фиолетового с йодом под действием спирта. Результат окраски по методу Грама определяется особенностями строения и химического состава клеточной стенки бактерий и зависит от способности удерживать образовавшийся в процессе окраски комплекс генцианового фиолетового с йодом.

Фирмикутные бактерии окрашиваются грамположительно, поскольку имеют многослойный пептидогликан, связанный с тейхоевыми кислотами. Последние обусловливают прочную фиксацию красителя и резистентность к обесцвечиванию спир­том. Грациликутные бактерии окрашиваются грамотрица-тельно.

Окраска по методу Грама имеет важное дифференциально-диагностическое значение и широко используется в микробио­логии. К грамположительным бактериям относятся стафило­кокки, стрептококки, коринебактерии дифтерии и др., к грамотрицательным — гонококки, менингококки, кишечная палоч­ка и др. Некоторые виды бактерий (клостридии, гарднереллы) могут окрашиваться по методу Грама вариабельно в зависимос­ти от возраста культуры, особенностей культивирования и дру­гих факторов, воздействующих на структуру клеточной стенки.

Основная ошибка, допускаемая при окраске по методу Гра­ма, заключается в "переобесцвечивании" мазка этиловым спиртом. Грамположительные бактерии при этом могут утра­чивать первоначальную окраску генциановым фиолетовым и приобретать красный цвет (характерный для грамотрицатель-ных бактерий) в результате последующей докраски мазка фук­сином. Грамотрицательные бактерии в свою очередь могут сохранять сине-фиолетовый цвет генцианового фиолетового. Для правильной окраски следует строго соблюдать технику обесцвечивания.

Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля-Ниль­сена

На фиксированный мазок нанести карболовый раствор фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подо­греть 3-5 мин до появления паров.

Снять бумагу, промыть мазок водой.

Нанести 5 % раствор серной кислоты или 3 % раствор смеси спирта с хлористоводородной кислотой на 1-2 мин. для обесцвечивания.

Промыть водой.

Докрасить мазок водным раствором метиленового синего в течение 3-5 мин.

Промыть водой, высушить и микроскопировать.

В основе метода лежат протравливание (разрыхление) кле­точной стенки бактерий для усиления поглощения красителя и избирательное обесцвечивание под действием кислоты. Кис-лотоустойчивость бактерий обусловлена особым строением их клеточной стенки с повышенным содержанием липидов: разветвленных жирных кислот (миколовых кислот), глико- и фос-фолипидов, восков. Клеточная стенка кислотоустойчивых бак­терий имеет очень низкую проницаемость, поэтому они пло­хо воспринимают красители. Раствор карболовой кислоты разрыхляет клеточную стенку и тем самым повышает ее тинк-ториальные свойства, а высокая концентрация красителя и нагревание в процессе окраски усиливают реакцию взаимодей­ствия красителя с бактериальными клетками, которые при этом окрашиваются в красный цвет. При обработке препарата серной кислотой некислотоустойчивые бактерии обесцвечива­ются и в дальнейшем окрашиваются метиленовым синим в голубой цвет, а кислотоустойчивые бактерии остаются окра­шенными фуксином в красный цвет (рис. 2.2.2; на вклейке).

Окраска спор по методу Ожешко

На нефиксированный мазок нанести 0,5 % раствор хло­ристоводородной кислоты и подогреть в течение 2-3 мин. на пламени.

Кислоту слить, препарат промыть водой, просушить и фиксировать над пламенем.

Окрасить по методу Циля-Нильсена.

Споры бактерий приобретают красный цвет, а вегетативные формы — синий (рис. 2.2.3; на вклейке). Споры бактерий име­ют многослойную клеточную стенку сложного строения, прак­тически непроницаемую для красителей, поэтому для повыше­ния их тинкториальных свойств используют более жесткие условия протравливания, чем для окрашивания кислотоустой­чивых бактерий.

Окраска спор по методу Шеффера-Фултона

На фиксированный мазок нанести 5 % раствор малахитового зеленого и 3-4 раза нагреть до появления паров.

Промыть водой.

Докрасить 0,5 % сафранином в течение 30 с.

4. Промыть водой, высушить и микроскопировать. Споры бактерий окрашиваются в зеленый цвет, вегетатив­ные клетки — в красный.

Окраска зерен волютина по методу Нейссера

На фиксированный мазок нанести ацетат синьки Нейссера на 2-3 мин.

Добавить раствор Люголя на 10-30 с.

Промыть препарат водой.

Докрасить водным раствором везувина или хризоидина в течение 0,5-1 мин.

Промыть препарат водой, высушить и микроскопиро­вать.

Зерна волютина представляют собой включения полифос­фатов, имеющие в отличие от цитоплазмы щелочную реакцию, и поэтому избирательно воспринимают ацетат синьки, окра­шиваясь в темно-синий цвет. Цитоплазма клетки, обладающая кислой реакцией, воспринимает щелочной краситель везувин и окрашивается в желтый цвет (рис. 2.2.4; на вклейке). Обнаружение макрокапсул по методу Бури-Гинса

Смешать каплю взвеси микробных клеток с каплей туши и при помощи стекла со шлифованым краем сделать мазок таким же образом, как мазок из крови, высушить и фиксировать.

На мазок нанести водный раствор фуксина на 1—2 мин.

Промыть водой, высушить на воздухе и микроскопировать.

Бактерии окрашиваются в красный цвет. Капсулы не окра­шиваются анилиновыми красителями, остаются прозрачными и контрастно выделяются на черно-розовом фоне (рис. 2.2.5; на вклейке).