Методы лабораторной диагностики лямблиоза

Материалом для исследований служат фекалии и дуоденальное содержимое. В дуоденальном содержимом обнаруживаются только трофозоиты L. intestinalis, в оформленных фекалиях - только цисты, в жидких и полуоформленных испражнениях - трофозоиты и цисты.

Классическим методом лабораторной диагностики лямблиоза являются протозоологические исследования.

· Микроскопическое исследование нативных и окрашенных раствором Люголя мазков из свежевыделенных фекалий.

Подготовка к исследованию.

1. Предварительно нанести на предметные стекла 1-2 капли физиологического раствора, раствора Люголя и метиленового синего.
2. Из пробы кала выбрать обычную порцию и порцию с патологическими признаками (слизь, кровь), смешать с каплей подготовленных на предметном стекле растворов, накрыть покровным стеклом.

3. Препарат должен быть почти прозрачным, светопроницаемой плотности, чтобы «можно было видеть газетный шрифт».
4. Микроскопировать при увеличении: окуляр х 10, объектив х 10, а затем окуляр х 10, объектив х 40. При необходимости можно осторожно использовать водную иммерсию и увеличение: окуляр х 10, объектив х 100.

При прохождении мною преддипломной практики в ГБУЗ ЛО «Волховской межрайонной больницы» проводила исследования по данному методу. Было просмотрено 67 препаратов, в которых цист лямблий не было обнаружено.

Учитывая циклическое выделение цист и трофозоитов с фекалиями, незначительные сроки жизни вегетативных форм во внешней среде, необходимо применять консервирующие жидкости для сохранения паразита в фекалиях и проводить многократные исследования (от 2 - 3 до 6 - 7 раз с интервалами 1-2 дня), а также использовать метод формалин-эфирного обогащения, метод флотации. В большинстве случаев цисты L. intestinalis в кале обнаруживаются уже при первом исследовании. Отрицательные периоды в выделении L. intestinalis могут колебаться от 2 - 3 суток до 2 - 3 недель. Поэтому при подозрении на лямблиоз можно также рекомендовать проводить протозоологическое исследование кала в течение 4-5 недель с интервалом в одну неделю.

В дуоденальном содержимом трофозоиты L. intestinalis обнаруживаются с большим постоянством, чем в фекалиях. Однако при паразитировании L. intestinalis в средних и дистальных отделах тонкой кишки результаты исследования дуоденального содержимого могут быть отрицательными, поэтому необходимо проводить исследование кала. Исследование секрета двенадцатиперстной кишки, полученного с помощью трехканального зонда в условиях вакуума, более эффективно для обнаружения паразита, чем микроскопия дуоденального содержимого, полученного с помощью обычных зондов. В настоящее время всё реже используется этот метод, т.к. он очень болезненный для пациента и требуется специально подготовленные сотрудники.

· Метод иммунохроматографического выявления антигена лямблий в фекалиях человека ( ИммуноХА - Лямблия - Экспресс).

Набор ИммуноХА - Лямблия - Экспресс предназначен для быстрого, качественного определения наличия специфического антигена лямблий в фекалиях человека методом иммунохроматографического анализа при диагностике лямблиоза и мониторинге лечения.

В основе определения лежит принцип иммунохроматографического анализа. Исследуемый образец всасывается поглощающим участком индикаторной полоски; при наличии в образце антигена лямблий последний вступает в реакцию с моноклональными антителами к антигену лямблий, связанными с частицами коллоидного золота, образуя окрашенный комплекс антиген–антитело. Этот комплекс движется с фронтом жидкости и связывается с другими антителами, иммобилизованными на мембране в виде линии, окрашивая ее в розово-фиолетовый цвет. Не связавшиеся реагенты продолжают двигаться по мембране дальше и образуют розово-фиолетовую линию в зоне контроля. Результаты реакции оценивают визуально(см.Рис. 1).

Положительный результат	Отрицательный результат	Ошибочный результат

Рисунок 1-Индикаторные полоски тест-системы

Выявление в рабочей зоне двух линий (тест и контроль) розово-фиолетового цвета свидетельствует о положительном результате анализа, т.е. в анализируемом образце фекалий содержится антиген лямблий, что свидетельствует о наличии в кишечнике самих паразитов.

Выявление в рабочей зоне только одной линии (контроль) розово-фиолетового цвета свидетельствует об отрицательном результате анализа, т.е. в анализируемом образце антигена лямблий нет или же его концентрация ниже порогового значения.

Если линия контроля не появилась, анализ признается недействительным, и определение необходимо повторить с использованием другой индикаторной полоски.

· Иммуноферментный анализ для определения антигена лямблий в фекалиях человека ( ИммуноФА – Лямблия - Ar)

Набор ИммуноФА-Лямблия-Аг предназначен для качественного определения наличия специфического антигена лямблий в фекалиях человека методом иммуноферментного анализа (ИФА) при диагностике лямблиоза и мониторинге его лечения. Набор рассчитан на проведение анализа 94 неизвестных образцов и 2 контрольных проб (всего 96 определений).

Определение основано на принципе двустадийного иммуноферментного «сэндвич» - анализа: сначала антиген лямблий, содержащийся в исследуемом образце, специфически связывается с сорбированными на твердой фазе (лунки полистироловых планшетов) моноклональными антителами к антигену лямблий, а затем после промывания - с другими антителами к антигену лямблий, конъюгированными с пероксидазой. Количество связавшегося конъюгата определяют с помощью раствора субстрата (3,3`,5,5` - тетраметилбензидин с добавлением перекиси водорода). Интенсивность окраски продукта окисления субстрата прямо пропорциональна концентрации антигена лямблий, содержащегося в анализируемом образце.

Оптическая плотность отрицательного контроля при правильно проведенном анализе должна находиться в пределах 0,050 - 0,100 ед. ОП, а положительного - в пределах 1,0 - 2,0 ед. ОП.

Образцы с оптической плотностью, превышающей оптическую плотность отрицательного контроля на 0,050 ед. ОП и более, следует рассматривать как положительные.

Образцы с оптической плотностью, превышающей оптическую плотность отрицательного контроля менее чем на 0,050 ед. ОП, следует рассматривать как сомнительные. В этом случае анализ следует повторить.

Иммуноферментный анализ для определения антител
к антигенам лямблий в сыворотке крови.

Тест-система предназначена для выявления IgM и IgG к антигенам лямблий в сыворотке крови обследуемых лиц при диагностике острого лямблиоза в комплексе с другими методами, при изучении патогенеза и иммуногенеза лямблиоза в клинических и научно-исследовательских лабораториях.

Определение основано на принципе двустадийного иммуноферментного «сэндвич» - анализа: сначала антитела лямблий, содержащиеся в сыворотке крови, специфически связываются с сорбированными на твердой фазе (лунки полистироловых планшетов) антигенами лямблий, а затем - после промывания - с другими антигенами к антителам лямблий, конъюгированными с пероксидазой. Количество связавшегося конъюгата определяют с помощью раствора субстрата (3,3`,5,5`-тетраметилбензидин с добавлением перекиси водорода). Интенсивность окраски продукта окисления субстрата прямо пропорциональна концентрации антител лямблий, содержащихся в анализируемом образце.

При правильно проведенном анализе оптическая плотность отрицательного контроля (ОП К¯) должна находиться в пределах 0,050–0,100 ед. ОП, а положительного – в пределах 1,0–2,0 ед. ОП.

Образцы с оптической плотностью, превышающей ОП К¯на 0,050 ед. ОП и более, следует рассматривать как положительные.

Образцы с оптической плотностью, ОП К¯ контроля менее чем на 0,050 ед. ОП, следует рассматривать как сомнительные. В этом случае анализ следует повторить.

Лямблии обитают в начальном отделе тонкой кишки, поэтому для него характерно развитие местных иммунологических реакций. Однако и в сыворотках крови зараженных лямблиями людей выявляются антитела к их антигенам, относящиеся к различным классам иммуноглобулинов. При воспалении слизистой оболочки кишечника ее проницаемость возрастает, и попадание антигенов лямблий в периферическую кровь увеличивается в результате резорбции. Выявление IgМ к антигенам лямблий в сыворотке крови может свидетельствовать о наличии острого лямблиоза, диагностика которого возможна на 10 - 14 день от начала инвазии. Выявление IgG к антигенам лямблий в сыворотке крови может свидетельствовать о наличии хронического лямблиоза.

Анализ на антитела нельзя назвать точным методом диагностики данного заболевания. Обычно полностью антитела к L. intestinalis исчезают из крови через 2-6 месяцев. К тому же иммуноглобулины класса G и M могут появиться в ответ на проникновение иных видов паразитов и бактерий.

В результате сравнительной характеристики лабораторных методов исследования был сделан вывод, что копрологический метод исследования на лямблиоз является наиболее точным и оптимальным, однако требует высокой подготовки и знаний медицинского лабораторного техника при проведении этого исследования. Метод ИФА в основном используется в совокупности с другими методами, поэтому он чаще используется для профилактики.