Оценка антикоагуляционного звена гемостаза.

Противосвертывающая система, которая ограничивает процессы свертывания крови, представлена несколькими белками. К основным физиологическим антикоагулянтам относятся антитромбин (АТ, ранее антитромбин III), и система протеина С («си»). Эти системы имеют различный механизм действия: АТ ингибирует ферменты свертывания, а система протеина С инактивирует кофакторы ферментов, поэтому исследования должны включать анализ обеих систем. Дефицит или дефект как одного, так и другого антикоагулянта являются подтвержденными факторами риска развития тромбозов.

Антитромбин.

Антитромбин – это гликопротеид с ОММ 58000Д, который синтезируется в печени. В связи с низкой ОММ (<70000Д) он легко выводится через почки. АТ ингибирует сериновые протеазы, в первую очередь тромбин (ф. IIа) и ф. Ха. В присутствии гепарина активность АТ увеличивается в тысячи раз. Противосвертывающее действие гепарина реализуется через АТ, без которого гепарин не оказывает антикоагулянтного эффекта. По литературным данным, на долю АТ приходится 75-90% всего антикоагулянтного потенциала.

Методы определения.

1. Клоттинговые методы. Это скриниговые функциональные методы, которые оценивают активность АТ по ингибирующему действию на тромбин. Тест калибруется по нормальной донорской плазме и оценивается в процентах. Референтные значения составляют от 75 до 125%.

2. Методы с хромогенным субстратом позволяют оценить амидолитическую активность АТ, которая может не соответствовать его биологической активности. Однако простота и доступность метода получили широкое распространение в КДЛ.

3. Иммунохимические методы определяют концентрацию антитромбина.

Снижение активности(гиперкоагуляция).

Врожденное: дефицит или аномалии АТ.

Приобретенное:

Заболевания печени (снижение синтеза).

Выраженная протеинурия (повышенное выведение АТ через почки).

Злокачественные новообразования (активация коагуляции, рост потребления).

Прием оральных контрацептивов, кортикостероидов, лечение L-аспарагиназой.

Беременность и поздние токсикозы беременности (гестозы).

Массивное образование тромбина (ДВС, сепсис, терминальные состояния).

Лечение большими дозами гепарина.

Большинство случаев дефицита АТ является приобретенным. Следует иметь в виду, что при снижении АТ <60% резко повышается риск развития тромбозов, поэтому всем пациентам с тромбофилиями и указанными выше состояниями необходимо определять активность АТ. Перед лечением большими дозами гепарина, в том числе ДВС-синдрома, контроль АТ исключительно полезен, так как при падении уровня АТ гепарин не оказывает эффекта. Установлено, что восстановление уровня антикоагулянтов при остром и подостром ДВС-синдроме свидетельствует о благоприятном прогнозе заболевания.

Повышение активности(гипокоагуляция): острый вирусный гепатит, холестаз, прием анаболических стероидов, лечение АНД.

Система протеина С.

Основными белками системы протеина С являются протеин С и его кофактор протеин S. Это витамин К-зависимые сериновые протеазы, которые синтезируются в печени. Действие системы протеина С направлено на инактивацию факторов VIIIа и Vа - ускорителей процесса свертывания плазмы. При активации системы протеина С также ингибируется PAI-1, что приводит к запуску фибринолиза. Белки системы протеина С в физиологических условиях активируются тромбином. Для активации необходимо наличие фосфолипидов и Са⁺⁺, что характерно для всех витамин К-зависимых факторов. В условиях in vitro система запускается протаком – активатором из яда змеи щитомордника.

Тесты системы протеина С включают оценку общей активности системы протеина С, определение активности протеина С, протеина S, фактора Vа.

Методы определения.

Оценка системы протеина С может проводиться с помощью клоттинговых и иммунохимических методов, а также с использованием хромогенных субстратов.

Скрининговый метод оценки общей активности системы протеина С.

Метод разработан на основе модифицированного теста АЧТВ. При наличии в плазме активированного протеина С (АПС) время свертывания плазмы здорового человека удлиняется за счет инактивации факторов VIIIа и Vа. Активация проводится добавлением протака. При проведении теста измеряется время свертывания плазмы пациента с АПС и без АПС. В некоторых модификациях метода время свертывания плазмы пациента сравнивается со временем свертывания нормальной донорской плазмы. В методике анализа приводится формула для расчета нормализованного отношения и критерии оценки теста в цифровом выражении, которые зависят от используемых реагентов.

У ряда пациентов практически отсутствует удлинение АЧТВ при добавлении АПС. В связи с этим был введен термин «резистентность к активированному протеину С».

Снижение активности системы протеина С обусловлено одной из трех причин: дефицитом протеина С, дефицитом протеина S или резистентностью фактора Vа к АПС. Структурное изменение молекулы ф. V ведет к невозможности его полной инактивации под действием АПС. Для дифференциальной диагностики нарушений проводят тесты, указанные выше, в полном объеме.

Несмотря на то, что на долю системы протеина С приходится всего 10-15% всей антикоагуляционной активности крови, снижение уровня протеина С и его кофакторов до 50% от нормы приводит к появлению рецидивирующих венозных тромбозов, ювенильных тромбозов, которые появляются в молодом возрасте, и тромбэмболий. Гомозиготная недостаточность протеина С вызывает развитие фульминантной пурпуры у детей, практически несовместимой с жизнью. Гетерозиготный дефицит проявляется ранними тромбозами.

Снижение активности(гиперкоагуляция).Различают наследственные и приобретенные факторы, снижающие активность системы протеина С.

Наследственные факторы: мутации в генах протеина С, протеина S, фактора V. Мутация фактора V Лейден, наиболее распространенная среди европейского населения, вызывает резистентность к АПС.

Приобретенные факторы: наличие волчаночных антикоагулянтов, беременность, избыток фактора VIII, возраст старше 50 лет, ДВС-синдром, заболевания печени, сепсис, лечение L-аспарагиназой, дефицит витамина К, лечение варфарином и другими АНД.

Антикоагулянты непрямого действия снижают синтез всех витамин-К-зависимых факторов, в том числе протеина С и протеина S. Варфарин, назначенный пациентам с низкой активностью протеина С, провоцирует тромбозы и некрозы кожи. Перед назначением варфарина, особенно пожилым и лицам с ранними тромбозами, необходимо проводить тест на общую активность системы протеина С. При низкой активности системы варфарин рекомендуется вводить постепенно, начиная с малых доз, или заменить фракционированным гепарином.

Оценка уровня тромбинемии.

Процессы свертывания крови у человека идут постоянно, но они носят локальный характер. При активации процессов свертывания происходит повышенная генерация тромбина, который в физиологических условиях запускает процесс превращения растворимого фибриногена в нерастворимый фибрин. Очевидная оценка уровня коагуляции по количеству тромбина привлекательна, но недоступна, так как тромбин имеет короткий срок жизни, и определить его количество в плазме практически невозможно. Уровень тромбинемии, и, соответственно, активность процессов свертывания, оценивают по продуктам, которые образуются при активации протромбина и превращении тромбином фибриногена в фибрин.

При активации протромбина образуются различные продукты, но обязательным является формирование тромбина и фрагмента F1+2, между которыми существует стехиометрическое соотношение. По уровню F1+2 можно отслеживать как гиперкоагуляцию (рост), так и гипокоагуляцию (снижение). Время жизни фрагмента F1+2 составляет 30 мин. При взаимодействии тромбина с антитромбином образуются тромбин-антитромбиновые комплексы (ТАТ), которые также могут быть использованы в качестве маркера тромбинемии. Однако наиболее доступный способ оценки уровня тромбинемии - определение веществ, которые образуются при активации и разрушении фибриногена и фибрина.

При активации тромбином фибриногена от последнего отщепляются два фибринопептида А (ФПА), два фибринопептида В (ФПВ) и образуется фибрин-мономер. Определение ФПА достаточно давно используется как маркер активации гемостаза, однако он быстро выводится почками. Фибрин-мономер формирует фибрин-олигомеры и полимеры растворимого фибрина, которые под действием фибрин-стабилизирующего фактора (XIII) превращаются в нерастворимый фибрин (рис.3). Далее фибриновый сгусток лизируется плазмином с образованием Д, Е, Д-Е и Д-Д-фрагментов фибрина - Д-димеров. При высокой активности плазмина, снижении уровня антиплазминов и высоком уровне фибриногена плазмин может расщеплять фибриноген с образованием Д, Е, и Д-Е-фрагментов. Все эти продукты называются продуктами деградации фибрина/фибриногена (ПДФ). Их количество можно измерять иммунологическими методами с использованием поликлональных антител.

У здорового человека уровень ПДФ очень мал и не всегда определяется обычными лабораторными тестами. Кроме того, ПДФ утилизируются фагоцитами. При активации свертывания крови уровень ПДФ возрастает, происходит расширение пула фибриногена, и одновременно активируется фибринолиз. Продукты начинают взаимодействовать между собой, образуя растворимые фибрин-мономерные комплексы (РФМК), которые препятствуют полимеризации фибриногена и тем самым выполняют роль вторичных антикоагулянтов. Из всех ПДФ единственным фрагментом, который образуется только из фибрина тромба, являются Д-димеры.

Доступные методы определения составляющих ПДФ.

Паракоагуляционные тесты.

К паракоагуляционным тестам относятся орто-фенентролиновый, этаноловый и протаминсульфатный. Они основаны на образовании геля или хлопьев при добавлении к плазме крови пациента с тромбинемией орто-фенантролина, 50% этанола или протаминсульфата. В настоящее время о-фенантролиновый тест используется как полуколичественный. Остальные методы считаются мало чувствительными, плохо воспроизводимыми и устаревшими.

Определение РФМК орто-фенантролиновым методом.

Метод основан на появлении хлопьев паракоагулята при добавлении о-фенантролина к бедной тромбоцитами плазме пациентов. Время появления хлопьев отражает степень тромбинемии: чем выше уровень РФМК, тем раньше появляются хлопья. Тест ручной полуколичественный. Реагенты отечественные.

Повышение РФМК (гиперкоагуляция) наблюдается во всех случаях тромбинемии: при тромбофилии, тромбозах и тромбэмболях, беременности, высоком уровне фибриногена, ДВС-синдроме. Тест может применяться для оценки эффективности и достаточности проводимой антикоагулянтной терапии по конечному результату – ликвидации тромбинемии. Для подтверждения или исключения наличия тромбов метод применяться не может.

Растворимый фибрин (РФ).

Иммунологические тест-системы для определения РФ выпускаются зарубежными производителями. Так как реакция основана на взаимодействии фибрин-мономеров с антителами к ним, тест реально определяет фибрин-мономеры, которые образуются только из фибриногена. Их уровень резко повышается при генерализации процессов свертывания, то есть при ДВС-синдроме. Во всех остальных ситуациях фибрин-мономеры либо полимеризуются, либо присоединяются к другим ПДФ и в свободном виде встречаются в крайне низких концентрациях. Поэтому данный метод подходит исключительно для диагностики и мониторинга ДВС-синдрома.

Д-димеры.

Это специфические продукты деградации фибрина, входящего в состав тромба. Концентрация Д-димеров пропорциональна активности фибринолиза и количеству лизированного фибрина, то есть размеру тромба.

Для определения концентрации Д-димеров применяются иммунологические методы с использованием моноклональных антител. Производятся наборы реагентов для ИФА-диагностики, латексной агглютинации, иммунодиффузии, иммунотурбидиметрии.

Повышение уровня Д-димеров наблюдается при тромбозе глубоких вен, ТЭЛА, ДВС, тромбофилии, беременности (увеличение в 3-4 р.), лечении тромболитиками, обширных гематомах, а также при онкологических заболеваниях, инфекциях, воспалении, болезнях печени, в возрасте старше 80 лет, при наличии ревматоидного фактора, при заживлении ран.

Снижение уровня Д-димеров наблюдается при лечении антикоагулянтами прямого и непрямого действия.

Для Д-димеров наиболее характерна отрицательная диагностическая значимость (около 100%). Метод может использоваться для исключения диагноза тромбоза, так как отрицательный результат с высокой долей вероятности позволяет исключить этот диагноз.

Выявление эффектов волчаночного антикоагулянта (ВА).

Волчаночные антикоагулянты (Lupus Anticoagulants, LA) – это иммуноглобулины классов А, М и G, действие которых направлено против фосфолипид-белковых комплексов. Так как фосфолипиды неотделимы от процессов свертывания, антитела к ним замедляют процессы свертывания плазмы во всех флосфолипид-зависимых тестах без снижения активности отдельных факторов. Понятие относительно виртуальное, так как ВА не выделены и не идентифицированы. Их присутствие оценивают по оказанному эффекту - удлинению времени свертывания БТП в фосфолипидзависимых тестах (АЧТВ, ПТ). ВА обнаруживаются при АФС, СКВ и других коллагенозах, вирусных инфекциях, лечении некоторыми фармакологическими препаратами. В основе появления ВА лежит аутоиммунная патология.

Анализ на ВА назначают при наличии клинической симптоматики (артериальные или венозные тромбозы, особенно в детском и молодом возрасте, относительная тромбоцитопения и др.). В настоящее время на ВА обследуют беременных женщин, так как почти половина спонтанных абортов на ранних сроках беременности связана с наличием АФС. Алгоритм выявления ВА представлен на рис. 8.

В условиях обычной КДЛ для выявления эффекта ВА, как правило, проводятся скриниговые тесты, которые выявляют эффекты ВА, то есть удлинение времени свертывания в фосфолипидзависимых тестах: каолиновом времени свертывания БТП, тесте с разведенным тромбопластином, тесте с ядом гюрзы или гадюки Рассела, тесте с использованием тромбопластина с высокой чувствительностью к ВА. Наиболее часто используются последние два теста.

Для исследования на ВА используется корректно полученная бедная тромбоцитами плазма (БТП). Использование гепаринизированной и замороженной плазмы не допускается. Все тесты проводятся клоттинговым методом. Мануальное проведение тестов возможно, но точность анализов возрастает при работе на коагулометре. Оценка тестов основана на сравнении показателей коагуляции пациента и здорового донора, поэтому анализ плазмы больного проводится параллельно с анализом нормальной плазмы.

Основные скриниговые тесты.

Тесты с разведенным ядом гюрзы или гадюки Рассела. Коагулазы этих змей – фосфолипидзависимые активаторы фактора Х. Удлинение времени свертывания плазмы пациента по сравнению с контрольной (донорской) плазмой может быть связано с ВА. Для теста рассчитывают так называемое нормализованное отношение (НО, NR), которое учитывает степень замедления свертывания плазмы. Расчет показателя и интерпретация результатов зависят от используемых реагентов и указаны в методике анализа

Тест с АЧТВ-реагентом, чувствительным к ВА. Чувствительность АЧТВ-реагентов к ВА зависит от входящих в состав набора фосфолипидов. Использование АЧТВ-реагентов, нечувствительных к ВА, практически не удлиняет время свертывания плазмы пациентов, имеющих ВА. Использование АЧТВ-реагентов, чувствительных к ВА, существенно удлиняет время свертывания плазмы пациентов при наличии ВА по сравнению с донорской плазмой. Расчет степени замедления свертывания плазмы и интерпретация полученных результатов зависят от используемых реагентов и указаны в методике анализа.

Удлинение времени свертывания БТП может быть связано не только с эффектом ВА, но также с дефицитом или патологическим ингибированием факторов. Поэтому рекомендуется проводить подтверждающие тесты, которые устанавливают, что гипокоагуляция в скриниговых тестах обусловлена наличием ВА. Для этого необходимо иметь пул донорской плазмы и раствор мембран разрушенных тромбоцитов или эритрофосфатида.

1. При дефиците факторов добавление 10% донорской плазмы укорачивает время АЧТВ, а добавление 50% объема донорской плазмы нормализует время.

2. При наличии ВА нормализация времени свертывания БТП наступает после добавления мембран разрушенных тромбоцитов или эритрофосфатида.

3. При патологическом ингибировании факторов наблюдается отсутствие коррекции гипокоагуляции в обоих случаях (при добавлении мембран и плазмы) (табл. 9). Ингибирование факторов в большинстве случаев связано с образованием антител класса IgG. Антитела обычно появляются при аутоиммунных заболеваниях, при лечении антибактериальными препаратами, после беременности, у пожилых и при проведении кровозамещающей терапии.

Табл.9.

Тесты, подтверждающие наличие ВА.

Патология	Тест на ВА	Коррекция тромбоцитами или эритрофосфатидом	Коррекция плазмой
Наличие ВА	+	+	-
Дефицит факторов	+	-	+
Ингибирование факторов	+	-	-

Наличие ВА не является синонимом антифосфолипидного синдрома или системной красной волчанки (СКВ). Для диагностики АФС необходимо измерить уровень антител к мембранным фосфолипидам и к гликопротеидам, связанным с фосфолипидами. Только при повышении содержания обеих групп антител, выявлении ВА и наличии клинической симптоматики возможна постановка диагноза АФС. СКВ диагностируется другими методами.