I. Оценка клеточного звена иммунитета

1. Количественные методы

• тесты розеткообразования
• определение субпопуляций лимфоцитов с помощью моноклональных антител -МКАТ с использованием флюоресцентной или ферментной метки
• проточная цитометрия

Оценка функциональной активности клеток иммунной системы

• РБТЛ-реакция бластной трансформации лейкоцитов
• РТМЛ- реакция торможения миграции лимфоцитов

II. Оценка гуморального звена иммунитета

· определение уровня иммуноглобулинов классов A,M, G в сыворотке крови и секретах

· определение циркулирующих иммунных комплексов ЦИК)

III. Оценка фагоцитарного звена

· определение поглотительной способности нейтрофилов

· определение переваривающей способности нейтрофилов

IV. Оценка системы комплемента

Определение уровня комплемента в сыворотке крови

Определение компонентов комплемента (С1, С3, С5 и др.)

Выделение мононуклеаров крови для тестов розеткообразования и МКАТ

Наслаивание центрифугирование

Венозная кровь градиент

+гепарин плотности

+среда199 (верографин+фиколл)

плазма

кольцо агранулоцитов отбор агранулоцитов

градиент

эритроциты+гранулоциты

отмывание клеток подсчет в камере Горяева разведение.

Количественные методы.

ТЕСТЫ РОЗЕТКООБРАЗОВАНИЯ

Е-РОК

Т-лимфоциты имеют на своей поверхности рецепторы для эритроцитов барана, поэтому их называют Е –РОК (розеткообразующие клетки с эритроцитами). Взвесь лимфоцитов соединяют со взвесью эритроцитов барана.

взвесь эритроциты розеткообразование

лимфоцитов барана (Т-лимфоциты)

Взвесь инкубируют, делают мазки , окрашивают, находят 100 лимфоцитов, определяют процент розеткообразующих клеток (лимфоциты, присоединившие к себе 3 и более эритроцитов) –это и будет процент Т- лимфоцитов.

Норма-48-65%, абс. – 0,72 –2,22 (х10⁹г/л).

ЕАС-РОК

2) В-лимфоциты имеют на своей поверхности рецепторы к комплементу (С).

Для выявления В-лимфоцитов готовят ЕАС-комплекс:

Е-эритроциты

А-антитела-гемолизины

С- комплемент

Далее реакция проводится и учитывается аналогично Е-РОК.

Лимфоциты ЕАС-комплекс розеткообразование

(В-лимфоциты)

Норма ЕАС –РОК (В-лимфоцитов) – 10-27%, , абс. 0,15-0,92(х10⁹г/л).

О-клетки, т.е. лимфоциты, не имеющие признаков ни Т , ни В- лимфоцитов. Определяются по формуле:

О-кл. = 100 – (Т-кл +В-кл-).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ В РЕАКЦИИ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ (РИФ) С ПОМОЩЬЮ МКАТ

На поверхности лимфоцитов находятся группы рецепторов, называемые кластерами детерминант (CD). Для каждой субпопуляции лимфоцитов характерны определенные СD. Принцип метода основан на том, что мышиные моноклональные антитела - МКАТ присоединяются к соответствующим рецепторам на поверхности лимфоцитов, а участки их фиксации выявляются с помощью антител к иммуноглобулинам мыши, меченных флюорохромом (краситель, светящийся в ультрафиолетовых лучах).

Принцип метода.

АГ-детерминанта (CD)

Лимфоцит МКАТ АТ к Ig мыши, меченные флюорохромом

(мышиные)

При люминесцентной микроскопии участки, где образовались такие комплексы, будут светиться. Находят 200 лимфоцитов, определяют процент светящихся клеток, что соответствует проценту данной субпопуляции лимфоцитов. Определяют также абсолютное содержание (т.е. количество клеток в 1л крови) каждой субпопуляции.

СD3- присутствует на зрелых Т-лимфоцитах.

CD4 – обнаруживается на Т-лимфоцитах, обладающих хелперной функцией

CD8- находится на Т-лимфоцитах, обладающих эффекторной (цитотоксической) активностью.

CD19, CD20, CD22 – находятся на В-лимфоцитах

CD 16- находится на натуральных киллерах (NK- клетки)

Нормы: CD3 - 55-80%

CD4 - 31-49%

CD8 - 19-37%

CD19 - 5-19%

CD16 - 5-18%

Иммунорегуляторный индекс – ИРИ- = CD4/CD8. Норма - 1,3-1,5.

В настоящее время известно более 250 CD- антигенов.

При иммунодефицитных состояниях снижается количество лейкоцитов, лимфоцитов, Т-лимфоцитов, Т-хелперов. ИРИ меньше 1,0. Например, при прогрессирующей гнойной интоксикации снижается количество Т-клеток, Т-хелперов, увеличивается количество супрессоров. Снижается ИРИ до 0,5-0,4 , нарастает содержание О-клеток.

При аутоиммунных заболеваниях нарастает содержание Т-хелперов, В-клеток. Снижается количество Т-супрессоров. ИРИ обычно около 2.

§ определение субпопуляций лимфоцитов

- в реакции иммунофлюоресценции (РИФ) с моноклональными антителами (МКАТ),

- с помощью ферментных меток (иммуноцитохимия) – стрептавидин- биотиновый метод,

- с помощью проточного цитометра.