Основные этапы исследования гемостаза.
При изучении системы гемостаза, как и при других лабораторных исследованиях, анализ складывается из 3-х этапов:
- преаналитического, включающего назначение исследования, оформление бланка-заказа на анализ, забор, хранение и транспортировку биологического материала, иногда первичную обработку биологического материала (центрифугирование и отделение плазмы от эритроцитов);
- аналитического, то есть непосредственного проведения анализа;
- постаналитического, включающего выдачу анализа в отделение, лечащему врачу или пациенту, и интерпретацию результатов лабораторных исследований.
На каждом из этих этапов могут быть допущены ошибки. По статистическим данным 70-80% всех ошибок приходится на преаналитический этап, поэтому все составляющие этого этапа должны быть стандартизированы и неукоснительно выполнены.
Преаналитический этап. Назначение анализов проводится лечащими врачами и включает как стандартную коагулограмму, так и дополнительные тесты. Назначение анализов должно быть обосновано. Обоснованием служат данные анамнеза, данные клинического обследования (наличие геморрагий, признаки венозного застоя или артериальной недостаточности). Также учитывается информация о приеме лекарственных препаратов, прямо или косвенно влияющих на гемостаз.
При назначении анализов необходимо правильно заполнить направление, что поможет и врачу-клиницисту, и врачу клинической лабораторной диагностики при интерпретации полученных результатов. Тесное сотрудничество врачей-клиницистов с врачом лаборатории по гемостазу помогает и в правильном назначении тестов, и в их расшифровке, тем более, что основную информацию дает не столько конкретный тест, сколько комбинация тестов.
Оформление бланка включает следующие пункты:
• ФИО, пол, возраст
• Отделение или фамилия лечащего врача
• Полный диагноз (диагностика геморрагического или тромботического состояния, контроль терапии антикоагулянтами, тромболитиками, беременность, др.).
• Указание фармакологических препаратов, косвенно влияющих на гемостаз (антибиотики, оральные контрацептивы и др.).
Дата Подпись врача
На процессы свертывания влияет множество лекарственных препаратов, эффекты которых могут быть как терапевтическими, так и побочными. Фармакотерапия нарушений гемостаза обсуждалась ранее. Побочные эффекты лекарств могут проявляться в виде влияния на тромбоциты или плазменные факторы. Анальгетики, как правило, снижают агрегацию тромбоцитов. Прием оральных контрацептивов и препаратов заместительной гормонотерапии активирует агрегацию тромбоцитов и факторов свертывания, снижает уровень антитромбина, что может способствовать тромбофилии. Антибиотики широкого спектра действия подавляют кишечную флору и связанный с ней эндогенный синтез витамина К, а также могут вызывать тромбоцитопению. Установлено наличие склонности к гипокоагуляции у пациентов после введения кровозаменителей и при лечении аспарагиназой и вальпроиевой кислотой. Эффекты препаратов необходимо учитывать при интерпретации результатов лабораторных исследований.
Физический и эмоциональный стресс активирует систему коагуляции и фибринолиза.
Биологическим материалом для исследования гемостаза может быть кровь, плазма и сыворотка крови.
Кровь необходима при регистрации тромбоэластограммы. Сыворотка используется крайне редко для измерения содержания ряда факторов или ПДФ. Сыворотка – это жидкость, остающаяся после свертывания крови и отделения клеточных элементов. Она не содержит фибриноген и некоторые другие факторы. Основным материалом для исследования системы гемостаза является плазма крови. Для получения плазмы при заборе крови в пробирку добавляется стабилизатор (антикоагулянт), который препятствует свертыванию крови. Плазма – это жидкость, полученная после отделения клеточных элементов без предварительного свертывания крови. Плазма содержит фибриноген и все факторы.
Забор крови на гемостаз проводится из пальца, мочки уха или из вены. Капиллярная кровь берется для некоторых специально адаптированных методов, таких как подсчет тромбоцитов, определение времени кровотечения, АЧТВ, ПВ, и у детей. При заборе капиллярной крови необходим достаточно глубокий прокол стерильным скарификатором и быстрое (10 сек) взятие первых капель крови, полученных самотеком без давления или сжатия. При переносе крови в пробирку с антикоагулянтом (цитратом натрия) она должна быть спущена в центр пробирки, а не растекаться по краям. Кровь с антикоагулянтом должна быть тщательно и аккуратно перемешана.
Стандартным является исследование крови, взятой из вены. Кровь забирают натощак или после легкого завтрака без жирной пищи из локтевой вены силиконированной иглой с широким просветом в пробирки с цитратом натрия. При взятии крови время наложения жгута должно быть минимальным (не более 2-х мин), так как стаз крови активирует свертывание. Если кровь одновременно берут в несколько пробирок, то пробирка для гемостаза должна быть второй. При заборе крови из катетера для исключения влияния гепарина предварительно спускают до 20 мл крови. Кровь с цитратом натрия сразу 2-3 раза перемешивают без встряхивания и пенообразования, и оставляют при комнатной температуре. В качестве контейнеров для взятия крови могут быть использованы силиконированные стеклянные пробирки, пластиковые пробирки или вакуумные пробирки с голубой крышкой, содержащие цитрат натрия. В обычные стеклянные пробирки забор крови недопустим, так как стекло активирует некоторые факторы свертывания крови (контактная активация).
Для тестов, где важно избежать высвождения тромбоцитарных факторов в период времени между забором крови и выполнением анализа, используют СТАД-пробирки. Эти пробирки содержат цитрат натрия, теофиллин, аденозин и дипиридамол. Последние три составляющих препятствуют агрегации тромбоцитов и высвождению из тромбоцитов биологически активных веществ.
Для предотвращения свертывания крови после забора для коагулологических исследований в качестве стабилизатора крови используется цитрат натрия (далее цитрат). Цитрат обратимо связывает ионы кальция, чем предотвращает свертывание крови. Цитрат также стабилизирует факторы VIII и V и дает возможность получить прозрачную плазму после центрифугирования. Соотношение цитрата и крови строго определено – 1:9. По рекомендациям ВОЗ концентрация раствора цитрата составляет 109мМ, что соответствует 3,8% цитрату, приготовленному из трехзамещенного 5,5 водного кристаллогидрата (Na3C6H6O7x5,5H2O), или 3,2% цитрату, приготовленному из трехзамещенного 2-х водного кристаллогидрата (Na3C6H6O7x2H2O). При использовании обычных градуированных пробирок в лаборатории наливают необходимое количество цитрата и отмечают фломастером уровень для крови. В вакуумных пробирках с голубой крышкой содержится стандартное количество цитрата, а уровень для крови уже отмечен.
Таблица 7.
Зависимость соотношения антикоагулянта и крови от гематокрита
| Гематокрит % | Антикоагулянт мл (3,8% цитрат натрия) | Общий объем мл |
| 1,4 | ||
| 22-26 | 1,3 | |
| 28-32 | 1,2 | |
| 34-38 | 1,1 | |
| 40-44 | 1,0 | |
| 46-50 | 0,9 | |
| 52-56 | 0,8 | |
| 58-60 | 0,7 | |
| >65 | 0,5 | |
| новорожденные | 0,25 | 5,0 |
Примечание: значения гематокрита, отмеченные жирным шрифтом, допускают использование стандартного количества цитрата.
Высокий и низкий гематокрит требуют коррекции соотношения цитрат-кровь (табл. 7). В этом случае кровь забирают в пластиковые пробирки с откорректированным количеством цитрата. На практике при гематокрите от 25 до 55% количество цитрата можно не менять.
Наибольшее число ошибок связано с неправильным соотношением цитрата и крови и плохим перемешиванием проб. Очень часто процедурные сестры кровь набирают выше или ниже метки. В этом случае происходит нестандартное разбавление факторов, что может привести к образованию сгустков или нарушению коагуляции в пробирке при ее отсутствии у пациента. Кровь со сгустками не анализируется!
Время проведения исследований для оценки функций тромбоцитов и некоторых других тестов (PAI-1) составляет 30-40 мин. Такие пробы должны быть взяты в том лечебном учреждении, где они анализируются. При оценке плазменного гемостаза пробы должны анализироваться в течение 4-х часов. Использование вакуумных пробирок продлевает время проведения анализа, образцы крови могут транспортироваться в профильную лабораторию. Пробы до исследования хранятся при комнатной температуре.
Предварительный этап обработки проб включает центрифугирование. Путем изменения режима центрифугирования получают плазму, содержащую различное количество тромбоцитов. Обогащенную тромбоцитами плазму (ОТП) получают центрифугированием крови в течение 5 мин при 1000 оборотов/мин. ОТП используют для подсчета количества и оценки функции тромбоцитов. Бедную тромбоцитами плазму (БТП) получают путем центрифугирования цитратной крови при 3000 оборотов/мин в течение 15 мин. Ее используют для исследования показателей плазменного гемостаза. Бестромбоцитная плазма получается при центрифугировании цитратной крови в течение 30 мин при 4000 об/мин. Центрифугирование при исследовании гемостаза лучше проводить в центрифугах с бакет-ротором. При взятии пробирок из такой центрифуги фазы не смешиваются. Медленная остановка центрифуги также препятствует смешиванию фаз.
При необходимости плазму можно однократно заморозить (-200 - -700С). Для замораживания рекомендуется использовать бестромбоцитную плазму. При высокой температуре замораживания (-200С) плазма должна анализироваться в течение 2-х недель. Размораживание плазмы проводится на водяной бане при 370С. Размороженная плазма сразу анализируется. В плазме, содержащей гепарин и ПДФ, показатели гемостаза после замораживания меняются.
Гемолизированная плазма не анализируется за исключением случаев внутрисосудистого гемолиза у пациента.
Аналитический этап включает непосредственное проведение анализа. Результат анализа зависит от метода исследования, качества реактивов, используемого оборудования и человеческого фактора. Снижение влияния человеческого фактора обеспечивает автоматизация аналитического процесса.
Для исследования гемостаза применяются следующие группы методов:
1. Клоттинговые, основанные на регистрации времени образования сгустка (clot – сгусток, тромб). Используются для выполнения скрининговых тестов, определения активности отдельных факторов свертывания и ингибиторов.
2. Хромогенные, основанные на фотометрическом определении активности факторов по расщеплению хромогенных или флуорогенных субстратов. Используются для выполнения скрининговых тестов, определения активности отдельных факторов свертывания и ингибиторов. Методы чувствительны и специфичны, легко адаптируются к биохимическим анализаторам. С их помощью можно достаточно надежно измерить содержание того или иного фактора, но не всегда возможно оценить его биологическую активность.
3. Иммунологические, основанные на реакции антиген-антитело (ИФА, латексная агглютинация, нефелометрия, турбидиметрия и др.). Используются для определения концентрации факторов.
4. Другие методы для специальных исследований (например, растворение сгустка, молекулярные методы и др.).
При выборе методов необходимо помнить, что понятия активности и концентрации факторов не всегда тождественны. Так, при лечении варфарином концентрация витамин-К-зависимых факторов, измеренная методом ИФА, может быть в пределах нормы, в то время как их активность в клоттинговых тестах будет снижена (удлинение ПВ и АЧТВ) из-за синтеза функционально неполноценных PIVKA-факторов.
Для калибровки исследования активности и большинства концентраций факторов используется пул цитратных плазм.
Нормальная плазма – это пул бестромбоцитных цитратных плазм, полученный не менее чем от 20 клинически здоровых доноров. В этой плазме активность всех факторов считается по определению как 100% или 1 ед/мл. Нормальная плазма и ее серийные разведения используются для многоточечной калибровки.
Референтная плазма (100% значения) – централизованно приготовленная в соответствии со стандартом нормальная плазма.
Калибровочная плазма – пул цитратных плазм, в котором активность или концентрация компонентов гемостаза точно определены, но могут отличаться от 100%. Калибровочная плазма и ее серийные разведения используются для многоточечной калибровки с учетом активности или концентрации, определенной производителем.
Коагулологические методы исследования плохо поддаются стандартизации. Показатели тестов зависят от качества и состава реактивов и используемого оборудования. Некоторые успехи достигнуты в стандартизации ПВ при использовании МИЧ и расчете МНО в контроле лечения АНД. Во избежание ошибок желательно пользоваться готовыми наборами реактивов, которые поставляют отечественные и зарубежные фирмы. Среди отечественных производителей тест-систем наиболее популярны реактивы фирм «Ренам» (Москва), «Технология-Стандарт» (Барнаул), «МедиоЛаб», (Москва). Рекомендуется использовать наборы одного и того же производителя и отрабатывать референтные значения показателей в условиях своей лаборатории. Для уверенности в правильности проводимых исследований и получении достоверных результатов каждой лаборатории необходимо ежедневно проводить внутрилабораторный контроль качества и участвовать во внешнем контроле качества, отечественном или международном. В связи с недостаточной стандартизацией тестов при внешней оценке качества, например ФСВОК, для большинства тестов учитываются не абсолютные значения времени свертывания плазмы, а степень удлинения или укорочения времени свертывания контрольной плазмы по сравнению с донорской плазмой, измеренных в условиях данной лаборатории.
Все клоттинговые тесты проводятся в силиконированной или пластиковой посуде. Тесты проводятся ручными методами на водяной бане с прозрачными стенками или на полуавтоматических и автоматических анализаторах гемостаза - коагулометрах. Ручные методы допускаются, но воспроизводимость и точность определения у них самая низкая. Это связано с невозможностью стандартизации процесса проведения анализа, осуществляемого разными операторами, а также со сложностью визуальной регистрации времени появления сгустка. Клоттинговые тесты ставятся в дублях. Расхождение времени образования сгустка в параллельных исследованиях должно быть менее 0,5 сек.
Более современным и распространенным является измерение параметров гемостаза с помощью коагулометров. В полуавтоматических коагулометрах автоматизирована только система регистрации. По системе регистрации образования сгустка различают оптические, оптико-механические, механические и турбидиметрические коагулометры. Оптические и оптико-механические приборы могут анализировать только плазму. Эти приборы имеют так называемый автоматический старт: добавление реактива в измеряемую кювету автоматически запускает регистрацию времени образования сгустка. При использовании нескольких реактивов в кювету, поставленную в ячейку для измерения, должен добавляться только последний (стартовый) реактив. В механических коагулометрах может анализироваться и плазма, и цельная кровь. Эти приборы не имеют автоматического старта, отсчет времени запускается механическим нажатием кнопки. Механические коагулометры особенно удобны для поликлиник при мониторинге пациентов, принимающих варфарин, по протромбину капиллярной крови. Автоматические коагулометры проводят всю процедуру анализа в соответствии с заданной программой. Некоторые коагулометры рассчитывают фибриноген по протромбину. Такая методика может быть использована при массовых скрининговых обследованиях, но малопригодна для обследования пациентов с патологией гемостаза.
Постаналитический этап включает заполнение бланка анализа, выдачу анализов из лаборатории и помощь лечащему врачу в интерпретации результатов. Некоторые лаборатории пишут заключение по коагулограмме. Ошибки постаналитического этапа чаще всего связаны с неправильным вписыванием в бланк результатов анализа. Использование современных технологий (автоматизация, компьютеризация, установка лабораторных информационных систем – ЛИС) резко снижает процент ошибок.