Комплемент, путн активации, функции. Значение в противоинфекционной защите. Методы определений активности и показатели.

Система комплемента - совокупность белков сыворотки крови, связанных каскадом последовательной активности при их взаимодействии с комплексом антиген-антитело - (классический путь), либо со структурами полисахаридной природы (альтернативный путь).

Классическая система комплемента состоит из 9 компонентов (от CI до С9) и трех регулирующих гомеостаз системы белков (ингибитора CI эстеразы, инактиватора СЗб и инактиватора С6). Третий компонент (СЗ) является центральным белком всей системы и его количество в сыворотке составляет примерно 75%всей массы белков комлемента.

Альтернативный путь активации включает белки (факторы) В и Д, а также пропердии. Для функционирования классического пути активации комплемента необходимы ионы Ca²⁺, a альтернативного Mg²⁺.

Процесс активациитомплемента протекает стадийно с образованием ферментных комплексов, которые действуют на последующий компонент. При этом из нативных молекул отдельных компонентов образуются многие биологически активные соединения, играющие важную роль в развитии воспаления, иммунного ответа, аллергии, а также в резистентности к инфекции. Для осуществления бактериолиза или цитолиза требуется активация компонентов комплемента от СЗ до С9 по классическому или альтернативному пути. В роли опсонинов выступают большие фрагменты СЗб, С4б - адсорбируясь на поверхности клеток, они усиливают фагоцитарную реакцию, способствуют иммунному прилипанию комплекса АГ-АТ-комплемент к поверсности иммунокомпетентных клеток (В-лимфоциты). Низкомолекулярныё фрагмента -полипептиды - СЗа, С5а способствуют высвобождению биогенных аминов (гистамина, серотонина) из тучных клеток, вызывают сокращение гладкой мускулатуры, повышают сосудистую проницаемость, вызывают хемотаксис нейтрофилов и моноцитов в очаг воспаления. Компоненты CI-C4 нейтрализуют некоторые вирусы. Синтез белков комплемента осуществляется клетками системы мононуклеарных фагоцитов, фибластов, печенью. У человека встречаются генетические дефекты по большинству компонентов комплемента. Клинически они проявляются в форме синдрома системной красной волчанки, рецидивирующих пиогенных инфекций, ангионевротическим отеком.

Данные о функциональной активности белков комплемента и их концентрации дают очень важную информацию о протекании заболевания, могут быть использованы для оценки тяжести течения, эффективности терапевтических мероприятий, прогноза заболевания.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СИСТЕМЫ КООМПЛИМЕНТА

I. Определение общей гемолитической активности классического пути. Сыворотку крови разводят физиологическим раствором 1:10 и вносят в пробирки в объеме от 0,05 до. 0,5 мл. Объем проб доводят до 1,5 мл физиологическим раствором и вносят по 1,5 мл гемолитической системы (смесь равных объемов 3% взвесей бараньих эритроцитов и гемолитической сыворотки). Пробирки инкубируют при 37°С 45 минут,- охлаждают при 4°С для остановки реакции и центрифугируют при 1500 оборотов 4-5 минут. После центрифугирования определяют объем сыворотки, вызывающий лизис 50% сенсибилизированных эритроцитов (условную гемолитическую единицу активности комлемента - СН 50), затем рассчитывают количество СН 50 на мл цельной сыворотки. У здоровых людей титр комлемента (СН 50 на мл) составляет примерно 40-60 СН 50.

Гемолитическую активность альтернативного пути комлемента определятт также, но вместо сенсибилизированных бараньих эритроцитов используют несенсибилизированные кроличьи эритроциты и физиологический раствор, содержащий ионы Mg, но без Са для блокирования классического пути активации.

2.0пределение функциональной активности отдельных компонентов. Этот метод позволяет определить численность функционально активных молекул в I мл сыворотки крови. Для этого к сенсибилизированным эритроцитам добавляют реагент на определенный компонент комплемента ( в качестве реагента используют либо смесь компонентов комлемента, исключая искомый, либо сывоттку крови, лишенную активности этого компонента. Сыворотку для титрования компонентов классического пути разводят в 40-50 -раз, а альтернативного - в 5-7 раз. Таким образом можно уста­новить дефект определенных компонентов и определить профиль комплемента при различных заболеваниях.

3. Иммунохимическое определение концентрации компонентов комплемента. Данный метод исследования позволяет определить концентрацию каждого из белков комплемента, используя антисыворотки (антитела) к ним. Концентрация белков выражается в г\л. Для определения используют .метод радиальной иммунрдиФФузии в arap^B^Mjgjie^

4 Определение активности комплемента и его компонентов методом радиального гемолиза в агаровом геле. Гемолитическую систему смешивают с расплавленным агаром в соотношении 1:7 и быстро выли­вают в стерильные чашки Петри. После застывания в агаре проделывают лунки диаметром 4.мм- (до 15 лунок на 1-ой чашке). Лунки заполняются испытуемыми сыворотками и помещают чашки в холодильник при 4°С на 21 час для диффузии белков комплемента в агар. Затем чашки помещают в термостат на 60 минут для проявления зон гемолиза. Критерием активности комплемента служит

квадрат диаметра зон гемолиза.

Фагоцитоз. Фагоциты. Стадии фагоцитоза. Механизмы внутриклеточной бактерицидное действие. Исходы (завершённый, незавершенный фагоцитоз). Хемотаксины, опсонины, происхождение и роль в противоинфекционном иммунитете.

Фагоцитоз - поглощение фагоцитом крупных макромолекулярных комплексов, бактерий. Клетки-фагоциты нейтрофилы и моноциты/макрофаги. Фагоцитировать могут также эозинофилы (наиболее эффективны при антительминтном иммунитете). Процесс фагоцитоза усиливают, обволакивающие объект фагоцитоза.

Опсонины - белки, усиливающие фагоцитоз: IgG, белки острой фазы (С-реакгивный протеин, маннансвязывающий лектин); липополисахаридсвязывающий протеин, компоненты комплемента -СЗЬ, С4Ь; сурфактантные протеины легких SP-A, SP-D.

Моноциты составляют 5-10 %, а нейтрофилы 60-70 % лейкоцитов крови. Поступая в ткань моноциты формируют популяцию тканевых макрофагов: купферовские клетки (или звездчатые ретикулоэндотелиоциты печени), микроглия ЦНС, остеокласты костной ткани, альвеолярные и интерстициальные макрофаги. Фагоциты направленно перемещаются к объекту фагоцитоза, реагируя на хемоатграктанты: вещества микробов, активированные компоненты комплемемента (С5а, СЗа) и цитокины. Плазмалемма фагоцита обхватывает бактерии или другие корпускулы и собственные поврежденные клетки. Затем объект фагоцитоза окружается плазмалеммой и мембранная везикула (фагосома), погружается в цитоплазму фагоцита. Мембрана фагосомы сливается с лизосомой, рН закисляется до 4,5; активируются ферменты лизосомы. Фагоцитированный микроб разрушается под действием ферментов лизосом, катионных белков дефензинов, катепсина G, лизоцима и др. факторов. При окислительном (дыхательном) взрыве в фагоците образуются токсичные антимикробные формы кислорода - перекись водорода Н202, супероксиданион 02-, гидроксильный радикал ОН-, синглетный кислород. Кроме этого антимикробным действием обладают окись азота и радикал NO-. Макрофаги выполняют защитную функцию еще до взаимодействия с другими иммунокомпетентными клетками (неспецифическая резистентность). Активация макрофага происходит после разрушения фагоцитируемого микроба, его процессинга (переработки) и презентации (представлении) антигена Т-лимфоцитам. Фагоцитоз может быть завершенным, завершающимся гибелью захваченного микроба, и незавершенным, при котором микробы не погибают. Примером незавершенного фагоцитоза является фагоцитоз гонококков, туберкулезных палочек и лейшманий.

9. Методы определения показателей фагоцитоза.

ИССЛЕДОВАНИЕ ФАГОЦИТАРНЫХ КЛЕТОК

Изучение фагоцитарных клеток осуществляется несколькими методами:

А. Прямым морфологическим методом. Микробы смешиваются с фагоцитами в пробирке или в организме лабораторных животных, через 15—120 минут из смеси приготавливаются микропрепараты на предметных стеклах, окрашиваются по Романовскому-Гимзе и подсчитываются число фагоцити­рующих фагоцитов и число фагоцитированных микробов. По ним производят расчет следующих показателей:

ФАГОЦИТАРНЫЙ ПОКАЗАТЕЛЕЛЬ = 100%*(число фагоцитирующих фагоцитов/общее число фагоцитов)

ФАГОЦИТАРНОЕ ЧИСЛО= (число фагоцитированных микробов/число активных фагоцитов)

ПОКАЗАТЕЛЬ ЗАВЕРШЕННОСТИ ФАГОЦИТОЗА=

(ФЧ(через 15мин)-ФЧ(через 120мин))/ФЧ(через15мин)*100%

Б. Непрямыми методами

Они основаны на определении функциональной активности различных стадий фагоцитарного процесса:

определение хемотаксического индекса позволяет установить способность фагоцитов к направленному передвижению в сторону хемоаттрактанта -активированного комплемента, экстракта микробов, казеината натрия и др. Подсчитывается отношение количества фагоцитов, проникающих через микропористые фильтры в опыте и в контроле;

аттракция фагоцитирующегося объекта к поверхности фагоцита определяется по изменению степени метаболизма фагоцита, которая суммарно определяется в тесте хемилюминесценцищбактерицидность, фагоцитов определяется по активности бактерицидных систем, заключенных в гранулах клеток:

перекиси водорода - пероксидазы, супероксидных ионов -супероксиддесмутазы, лизоцима и др. Переваривающая способность фагоцитов оценивается по активности

лизосомальных ферментов, кислой и щелочной фосфатаз, катепсина и др.