Основные принципы культивирования бактерии.Питательные среды.
Основные принципы культивирования микроорганизмов на питательных средах.1.Использование всех необходимых для соответствующих микробов питательных компонентов.2.Оптимальные температура, рН, rH2, концентрация ионов, степень насыщения кислородом, газовый состав и давление.Микроорганизмы культивируют на питательных средах при оптимальной температуре в термостатах, обеспечивающих условия инкубации. По температурному оптимуму роста выделяют три основные группы микроорганизмов.1.Психрофилы- растут при температурах ниже +20 градусов Цельсия.2.Мезофилы- растут в диапозоне температур от 20 до 45 градусов (часто оптимум- при 37 градусах С).3.Термофилы- растут при температурах выше плюс 45 градусов.
Краткая характеристика питательных сред.По консистенции выделяют жидкие, плотные (1,5- 3% агара) и полужидкие (0,3- 0,7 % агара) среды. Агар- полисахарид сложного состава из морских водорослей, основной отвердитель для плотных (твердых) сред. В качестве универсального источника углерода и азота применяют пептоны- продукты ферментации белков пепсином, различные гидролизаты- мясной, рыбный, казеиновый, дрожжевой и др.По назначению среды разделяют на ряд групп:
- универсальные (простые), пригодные для различных нетребовательных микроорганизмов (мясо- пептонный бульон- МПБ, мясо- пептонный агар- МПА);- специальные- среды для микроорганизмов, не растущих на универсальных средах (среда Мак- Коя на туляремию, среда Левенштейна- Иенсена для возбудителя туберкулеза);- дифференциально- диагностические- для дифференциации микроорганизмов по ферментативной активности и культуральным свойствам ( среды Эндо, Плоскирева, Левина, Гисса);
- селективные (элективные)- для выделения определенных видов микроорганизмов и подавления роста сопутствующих- пептонная вода, селенитовая среда, среда Мюллера.По происхождению среды делят на естественные, полусинтетические и синтетические.
Анатоксины
Препараты, содержащие модифицированные химическим путем экзотоксины, лишенные токсических свойств, но сохранившие высокую антигенность и иммуногенность. Эти препараты обеспечивают выработку антитоксического иммунитета (антитоксических антител - антитоксинов). Наиболее широко используются дифтерийный и столбнячный анатоксины. АКДС - ассоциированная коклюшно- дифтерийно- столбнячная вакцина.
3.----
Билет № 26
1. Основные принципы культивирования бактерии.Питательные среды.Основные принципы культивирования микроорганизмов на питательных средах.1.Использование всех необходимых для соответствующих микробов питательных компонентов.2.Оптимальные температура, рН, rH2, концентрация ионов, степень насыщения кислородом, газовый состав и давление.Микроорганизмы культивируют на питательных средах при оптимальной температуре в термостатах, обеспечивающих условия инкубации. По температурному оптимуму роста выделяют три основные группы микроорганизмов.1.Психрофилы- растут при температурах ниже +20 градусов Цельсия.2.Мезофилы- растут в диапозоне температур от 20 до 45 градусов (часто оптимум- при 37 градусах С).3.Термофилы- растут при температурах выше плюс 45 градусов.Краткая характеристика питательных сред.По консистенции выделяют жидкие, плотные (1,5- 3% агара) и полужидкие (0,3- 0,7 % агара) среды. Агар- полисахарид сложного состава из морских водорослей, основной отвердитель для плотных (твердых) сред. В качестве универсального источника углерода и азота применяют пептоны- продукты ферментации белков пепсином, различные гидролизаты- мясной, рыбный, казеиновый, дрожжевой и др.По назначению среды разделяют на ряд групп:
- универсальные (простые), пригодные для различных нетребовательных микроорганизмов (мясо- пептонный бульон- МПБ, мясо- пептонный агар- МПА);- специальные- среды для микроорганизмов, не растущих на универсальных средах (среда Мак- Коя на туляремию, среда Левенштейна- Иенсена для возбудителя туберкулеза);- дифференциально- диагностические- для дифференциации микроорганизмов по ферментативной активности и культуральным свойствам ( среды Эндо, Плоскирева, Левина, Гисса);
- селективные (элективные)- для выделения определенных видов микроорганизмов и подавления роста сопутствующих- пептонная вода, селенитовая среда, среда Мюллера.По происхождению среды делят на естественные, полусинтетические и синтетические.
3. Род MycoplasmaМикоплазмы - самые мелкие прокариотические микроорганизмы, не имеющие клеточной стенки (это придает им сходство с L - формами бактерий) и способные к паразитированию на мембранах эукариотических клеток.. Микоплазмы имеют трехслойную цитоплазматическую мембрану, обеспечивающую целостность микробных клеток и частично замещающую в функциональном отношении отсутствующую клеточную стенку.Представители рода микоплазм - паразиты и возбудители заболеваний (микоплазмозов) человека.. 12 видов встречаются у человека, из них наибольшее значение имеют M.pneumoniae (вызывает в основном пневмонии и ОРЗ), M.hominis, M.genitalum, M.fermentans (при вызываемых ими инфекциях преобладают урогенитальные поражения). В составе рода Ureaplasma выделено пять видов. Штаммы, выделенные от людей, составляют вид U.urealyticum, от КРС - U.diversum, от птиц - U.gallorale, от кошек - U.cati и U.felinum. Наиболее типичны мелкие кокковидные формы, выражен полиморфизм.В составе сред необходимы холестерин и стерины, нативные сыворотки, витамины, соли. Основным источником энергии являются углеводы (особенно глюкоза) или аминокислоты (аргинин).Используют различные варианты жидких, полужидких и плотных питательных сред, включающих гидролизаты мяса, казеина, ферментативный пептон, аутолизат пекарских дрожжей, сыворотку крови лошадей, основной субстрат - глюкозу (для глюкозоферментирующих микоплазм), аргинин (для аргинин- утилизирующих микоплазм), мочевину (для уреаплазм), селективные антибиотики (пенициллин и его синтетические аналоги, амфотеррицин, нистатин или низорал, для уреаплазм - линкомицин), индикатор рН (бромтимоловый синий или феноловый красный).Микоплазмы характеризуются выраженной гетерогенностью и изменчивостью антигенной структуры (антигенный полиморфизм).Среди антигенов выделяют белки - адгезины, фосфо - и гликолипиды, полисахаридные компоненты.Факторы патогенности1. Адгезины (обеспечивают взаимодействие с клетками хозяина).2. Эндотоксины (не тождественны ЛПС грамотрицательных бактерий).3. Гемолизины (особенно - у M.pneumoniae).4. Экзотоксины (плохо изучены и известны у немногих видов).5. Ферменты - фосфолипаза А, аминопептидазы, протеазы, нейраминидаза.Патогенез.Микоплазмы - мембранные паразиты и способны адсорбироваться на различных эукариотических клетках. Этому способствует подвижность патогенных микоплазм, связанная с хемотаксисом и наличием микроворсинок. Лабораторная диагностикаНаиболее оптимальна культуральная (бактериологическая) диагностика с использованием жидких и плотных питательных сред, особенно в сочетании с антибиотикограммой и определением титра микоплазм (уреаплазм) в нативных образцах., возможность определения конценрации (титр 10000 цветообразующих единиц - ЦОЭ имеет диагностическое значение) и чувствительности к различным препаратам на основе антибиотикограммы Наиболее чувствительна ПЦР - диагностика. Однако: возможны ложно - положительные и ложно - отрицательные результаты, длительность выявления положительных результатов контроля излеченности, невозможность определения титра микоплазм (не разработаны количественные методики ) и чувствительности к препаратам.Лечение должно быть основано на подборе чувствительных антибиотиков (чаще применяют макролиды, тетрациклины - доксициклин) и бактериологическом контроле эффективности лечения. У микоплазм имеются специфические вирусы, в т.ч. бактериофаги. В лечебных и диагностических целях они до настоящего времени не используются.Специфическая профилактика не разработана. Иммунитет нестойкий, серотипоспецифический.
Билет № 27
Анатоксины
Препараты, содержащие модифицированные химическим путем экзотоксины, лишенные токсических свойств, но сохранившие высокую антигенность и иммуногенность. Эти препараты обеспечивают выработку антитоксического иммунитета (антитоксических антител - антитоксинов). Наиболее широко используются дифтерийный и столбнячный анатоксины. АКДС - ассоциированная коклюшно- дифтерийно- столбнячная вакцина.
3. Вирус кори - представитель рода Morbillivirus семейства парамиксовирусов. У него отсутствует нейраминидаза. Обладает гемагглютинирующей, гемолитической и симпластической активностью. Вирус имеет гемагглютинин, гемолизин (F), нуклеопротеид (NP) и матричный белок, отличающиеся антигенной специфичностью и иммуногенностью. Лабораторная диагностика.1.Метод экспресс - диагностики - обнаружение вирусных антигенов методом флюоресцирующих антител в пораженных клетках. 2. Вирусологическая диагностика - исследуют кровь до появления сыпи, слизь из носоглотки заражением культур клеток. Определяют цитопатический эффект, идентифицируют вирус в РТГА, РН и МФА.3. Серологические методы - РСК, РТГА, ИФА.Специфическая профилактика.Применяют живые аттенуированные вакцины. У контактных можно проводить серопрофилактику противокоревым иммуноглобулином или иммуноглобулином донорским нормальным.3.65 Полиовирусы.Полиомиелит.Полиовирусы вызывают полиомиелит - острую инфекцию с поражением нейронов. Важнейшее биологическое свойство полиовирусов - тропизм к двигательным клеткам серого вещества спинного мозга Капсид вириона образован четырьмя белками, образующими внешнюю (VP1, VP2, VP3) и внутреннюю (VP4) поверхности капсида. Белки оболочки имеют значение в распознавании и прикреплению к клеточным рецепторам, высвобождении вирионной РНК внутри клетки, развитии параличей.По антигенным свойствам полиовирусы подразделяют на три типа, наибольшей вирулентностью и эпидемической активностью обладают полиовирусы 1 типа.Лабораторная диагностика 1.Вирусологическая диагностика включает выделение вируса на различных культурах клеток или на новорожденных белых мышах, с последующей идентификацией по цитопатическому эффекту, в РН, РТГА, РСК с эталонными сыворотками.2. Серологическая диагностика осуществляется в различных реакциях (в настоящее время - ИФА), необходимо исследование в парных сыворотках, выявление специфических IgM - антител.Иммунитет и специфическая профилактика.Иммунитет к полиовирусам прочный, обусловленный вируснейтрализующими антителами и клетками иммунной памяти. Для специфической профилактики используют убитые и живые ослабленные вакцины.
Билет № 28
1. Основные методы культивирования вирусов.
1.В организме лабораторных животных.2.В куриных эмбрионах.3.В клеточных культурах - основной метод. Типы клеточных культур.1.Первичные (трипсинизированные) культуры- фибробласты эмбриона курицы (ФЭК), человека (ФЭЧ), клетки почки различных животных и т.д. Первичные культуры получают из клеток различных тканей чаще путем их размельчения и трипсинизации, используют однократно, т.е. постоянно необходимо иметь соответствующие органы или ткани.2.Линии диплоидных клеток пригодны к повторному диспергированию и росту, как правило не более 20 пассажей (теряют исходные свойства).3.Перевиваемые линии (гетероплоидные культуры), способны к многократному диспергированию и перевиванию, т.е. к многократным пассажам, наиболее удобны в вирусологической работе- например, линии опухолевых клеток Hela, Hep и др.2. Гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ)- клеточно- опосредованная гиперчувствительность или гиперчувствительность типа 4, связанная с наличием сенсибилизированных лимфоцитов. Эффекторными клетками являются Т- клетки ГЗТ, имеющие CD4 рецепторы Сенсибилизацию Т- клеток ГЗТ могут вызывать агенты контактной аллергии (гаптены), антигены бактерий, вирусов, грибов, простейших. Близкие механизмы в организме вызывают антигены опухолей в противоопухолевом иммунитете, генетически чужеродные антигены донора- при трансплантационном иммунитете.Т- клетки ГЗТ распознают чужеродные антигены и секретируют гамма- интерферон и различные лимфокины, стимулируя цитотоксичность макрофагов, усиливая Т- и В- иммунный ответ, вызывая возникновение воспалительного процесса.Исторически ГЗТ выявлялась в кожных аллергических пробах (с туберкулином- туберкулиновая проба), выявляемых через 24 - 48 часов после внутрикожного введения антигена. Развитием ГЗТ на вводимый антиген отвечают только организмы с предшествующей сенсибилизацией этим антигеном.Классический пример инфекционной ГЗТ - образование инфекционной гранулемы (при бруцеллезе, туберкулезе, брюшном тифе и др.). Гистологически ГЗТ характеризуется инфильтрацией очага вначале нейтрофилами, затем лимфоцитами и макрофагами. Сенсибилизированные Т- клетки ГЗТ распознают гомологичные эпитопы, представленные на мембране дендритных клеток, а также секретируют медиаторы, активирующие макрофаги и привлекающие в очаг другие клетки воспаления. Активированные макрофаги и другие участвующие в ГЗТ клетки выделяют ряд биологически активных веществ, вызывающих воспаление и уничтожающих бактерии, опухолевые и другие чужеродные клетки - цитокины (ИЛ-1, ИЛ-6, альфа- фактор некроза опухолей), активные метаболиты кислорода, протеазы, лизоцим и лактоферрин.3. Стафилококки.В состав рода входит более 20 видов, из которых наибольшее значение имеют S.aureus, S.epidermidis, S.saprophyticus.Грамположительные кокки, для которых характерно взаиморасположение скоплениями в виде гроздей винограда. Имеют микрокапсулу, спор не образуют, жгутиков не имеют.Факультативные анаэробы, хемоорганотрофы. Хорошо растут на простых питательных средах На плотных средах образуют непрозрачные круглые (2-4 мм в диаметре) ровные колонии, окрашенные в цвет липохромного пигмента (кремовый, желтый, оранжевый). Кроме S- форм колоний могут образовывать R- формы. На жидких средах дают равномерное помутнение, затем выпадает рыхлый осадок.Обладают высокой биохимической активностью, образуют различные ферменты Каталаза- положительны, оксидаза- отрицательны. Углеводы ферментируют до кислоты без газа, разжижают желатин с образованием воронки, образуют сероводород. По наличию коагулазы их делят на две группы - коагулаза- положительные и коагулаза- отрицательные. Среди патогенных видов коагулаза - положителен лишь S.aureus, остальные - отрицательны.Видоспецифическими антигенами являются тейхоевые кислоты, белок А золотистого стафилококка. Антигенными свойствами обладают токсины.Факторы патогенности микрокапсулу, компоненты клеточной стенки (тейхоевые кислоты, белок А), ферменты и токсины. Факторами адгезии являются высокие гидрофобные свойства поверхностных структур. Компоненты клеточной стенки стимулируют развитие воспалительных реакций, основное значение в них имеют нейтрофилы. Разнообразные ферменты стафилококков играют роль факторов агрессии и защиты. Главным фактором является плазмокоагулаза, свертывающая сыворотку (плазму) крови и образующая тромбиноподобное вещество, обвалакивающее стафилококки и препятствующее действию защитных реакций организма. Экзотоксины:Мембраноповреждающие токсины могут повреждать эритроциты (гемолизины), лейкоциты, макрофаги, тромбоциты и др. Выделяют несколько типов, отличающихся по антигенной структуре, спектру лизируемых клеток, скорости действия.Эксфолиативные токсины оказывают дерматонекротическое действие (пузырчатка новорожденных).Экзотоксин, вызывающий синдром токсического шока. Высокосорбционные тампоны вызывали тяжелый эндотоксический шок у женщин.Энтеротоксины, с которыми связаны пищевые интоксикации. Энтеротоксины - термостабильные белки со свойствами суперантигенов. Они вызывают избыточный синтез интерлейкина 2, который и обусловливает интоксикацию. Интоксикации чаще связаны с употреблением инфицированных стафилококками молочных продуктов.5. Ряд экзотоксинов и других структур стафилококков обладают аллергизирующим действием, обусловливая эффект развития ГЗТ. Наличие перекрестно - реагирующих антигенов способствует развитию аутоиммунных процессов.6. Факторы, угнетающие фагоцитоз - капсула, белок А, тейхоевые кислоты, пептидогликан, токсины.Особые свойства возбудителя.1. Способность поражать практически любую ткань и орган.2. Очень высокая устойчивость среди неспорообразующих бактерий к факторам внешней среды.3. Постоянное пребывание на кожных покровах и сообщающихся с внешней средой слизистых оболочках.4. Суперантигенные свойства.5. Высокая изменчивость и антибиотикорезистентность, что имеет важное значение для эпидемического процесса.Постинфекционный иммунитет при стафилококковых инфекциях можно разделить на клеточный и гуморальный, антибактериальный и антитоксическийВ защите важную роль имеют антитоксины, антибактериальные антитела, антитела против ферментов патогенности, Т- лимфоциты, фагоциты (тканевые макрофаги при локализованных формах).Лабораторная диагностика. Применяют бактериологические, микроскопические и серологические методы. Основным является бактериологический метод.Материал для исследования - кровь, гной, слизь из носа и зева, отделяемое ран, мокрота (при пневмонии), испражнения (при колите), подозрительные продукты, рвотные массы и промывные воды желудка, испражнения - при пищевых интоксикациях.Проводят бактериоскопию, выявляя грамположительные кокки в виде гроздей винограда (стафилококки). Высевают материал на простые питательные среды. Подозрительные колонии отбируют и пересевают для изучения на дифференциальные среды - на кровяной агар (гемолиз), молочно - солевой и молочно - желточно - солевой агары (за счет NaCl угнетается рост посторонней микрофлоры, использование сред позволяет лучше выявить пигмент и лецитиназу). Выделенную культуру идентифицируют по видовым признакам, определяют наличие золотистого пигмента, плазмокоагулазную активность, сбраживание маннита, гемолиз, чувствительность к антибиотикам, проводят фаготипирование.Из серологических тестов чаще применяют РПГА и ИФА для выявления антител к видоспецифическим антигенам (тейхоевым кислотам).Для определения энтеротоксигенности чаще применяют биологический метод, определение энтеротоксина в реакции преципитации в агаре, определение РНК- азы (коррелирует с выработкой энтеротоксина).Профилактика и лечение Для проведения адекватной антимикробной терапии необходимо определение чувствительности культур к антибиотикам ( прежде всего - к бета- лактамовым), в тяжелых и затяжных случаях применяют донорский антистафилококковый иммуноглобулин. Для создания иммунитета применяют стафилококковый анатоксин, создающий антитоксический иммунитет.
Билет № 29
1. АнтибиотикиОдним из универсальных механизмов антогонизма микроорганизмов является синтез антибиотиков, которые тормозят рост и размножение микроорганизмов (бактериостатическое действие) или убивают их (бактерицидное действие). Антибиотики- вещества, которые могут быть получены из микроорганизмов, растений, животных тканей и синтетическим путем, обладающие выраженной биологической активностью в отношении микроорганизмов.Существует ряд требований к антибиотикам- эффективность в низких концентрациях;- стабильность в организме и в различных условиях хранения;- низкая токсичность или ее отсутствие;- выраженный бактериостатический и (или) бактерицидный эффект;- отсутствие выраженных побочных эффектов;- отсутствие иммунодепрессивного воздействия.Первыми открытыми антибиотиками были пенициллин (Флеминг) и стрептомицин (Ваксман).
Антибиотики могут быть разделены по происхождению, направленности и спектру действия, по механизму действия.По происхождению антибиотики могут быть:- бактериального (полимиксин, грамицидин);- актиномицетного (стрептомицин, левомицетин, эритромицин);- грибкового (пенициллин);- растительного (рафанин, фитонциды);- животного происхождения (интерфероны, лизоцим).По спектру действия антибиотики разделяют на:- действующие преимущественно на грамположительную микрофлору- пенициллин, эритромицин;- действующие преимущественно на грамотрицательную микрофлору- полимиксин;- широкого спектра действия ( на грам-плюс и грам-минус флору)- стрептомицин, неомицин;- противогрибковые- нистатин, амфотеррицин, леварин, низорал;- противотуберкулезные- стрептомицин, канамицин;- противоопухолевые- рифампицин;- противовирусные- интерферон, зовиракс, ацикловир.Антибиотики разделяют по механизму действия:- ингибиторы синтеза пептикогликана клеточной стенки ( пенициллин, цефалоспорин, ванкомицин, ристомицин). Действуют на имеющих клеточную стенку растущие бактерии, не действуют на L- формы, покоящиеся формы бактерий;- ингибиторы синтеза белка (стрептомицин, левомицетин, тетрациклин);- ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот, пуринов и аминокислот (налидиксовая кислота, рифампицин);- ингибиторы синтеза мембраны и цитоплазматической мембраны грибов (нистатин, полимиксин).
3. Пневмококки.Особое положение в роде Streptococcus занимает вид S.pneumoniae (пневмококк) - этиологический агент крупозной пневмонии, острых и хронических воспалительных заболеваний легких. От остальных стрептококков отличается морфологией (чаще диплококки в форме пламени свечи, плоскими концами друг к другу, обладают выраженной капсулой), антигенной специфичностью (имеют 83 серовара по капсульному полисахаридному антигену), высокой чувствительностью к желчи и оптохину, вызывают альфа - гемолиз. Главный фактор патогенности - полисахаридная капсула.Лабораторная диагностика. Основной метод диагностики - бактериологический. Материал для исследования - кровь, гной, слизь из зева, налет с миндалин, отделяемое ран. Решающим при исследовании выделенных культур является определение серогруппы (вида). Группоспецифические антигены определяют в реакции преципитации, латекс - агглютинации, коагглютинации, ИФА и в МФА с моноклональными антителами (МКА). Серологические методы чаще используют для диагностики ревматизма и гломерулонефрита стрептококковой этиологии - определяют антитела к стрептолизину О и стрептодорназе.
Билет № 30