Инсерционные (Is) последовательности и транспозоны
У микробных клеток есть еще 2 вида структурных компонентов ДНК: Is-последовательности и транспозоны.
Они относятся к мигрирующим генетическим элементам и могут кодировать свой собственный перенос (транспозицию) от одного нуклеоида к другому или между нуклеоидом и плазмидами. Это обусловлено их способностью определять синтез ферментов транспозиции и рекомбинации – транспозаз.
Более просто устроены инсерционные последовательности (Is-элементы).
Is-элементы (от англ. insertion – вставка, sequence – последовательность) обладают своеобразными генетическими свойствами.
Во-первых, они способны перемещаться по геному. При этом происходит репликация Is-элемента. Первичный экземпляр остается на прежнем месте, а копия встраивается в мишень. Места, куда встраиваются инсерционные последовательности, почти не обладают специфичностью. Функции, обеспечивающие способность к перемещению (транспозиции), закодированы в самом Is-элементе.
Во-вторых, транспозиция представляег собой редкое событие, которое происходит на порядок реже, чем спонтанные мутации.
В-третьих, в местах, смежных по отношению к инсерции, возникают делеции и инверсии бактериальных генов. Кроме этого, встроенная инсерция может либо активировать транскрипцию соседних генов, выступая в роли промотора, либо наоборот, ингибировать их.
Наконец, именно Is-элементы обеспечивают взаимодействие между нуклеоидом, плазмидами и эписомами (например – F-фактором).
В свободном состоянии Is-последовательности не обнаружены.
Транспозоны – это более сложно устроенные генетические элементы. Они состоят из 2500-20000 и более пар нуклеотидов. В отличие от инсерций, они могут быть в свободном состоянии в виде кольцевой молекулы. Кроме того, транспозоны могут перемещаться из хромосомы в плазмиды и наоборот, мигрируя с репликона на репликон. ДНК транспозонов окружена с обоих концов (фланкирована) последовательностями ДНК, напоминающими Is-элементы. Некоторые умеренные фаги (например, Mu-бактериофаг E.coli) устроены аналогично и по существу представляют собой гигантские транспозоны.
Транспозоны могут нести информацию о синтезе бактериальных токсинов и ферментов, модифицирующих антибиотики. Также они могут проникать в хромосому клеток животных или человека сходно с провирусами. Так как для интеграции в геном транспозоны не нуждаются в классической рекомбинации, а обладают собственной системой встраивания, то они могут широко горизонтально распространяться между различными видами бактерий.
Изменчивость микроорганизмов
Если наследственность отвечает за стабильность вида, то изменчивость определяет его способность приспосабливаться к постоянно меняющимся условиям среды. В процессе развития популяции бактерий появляются отдельные клетки, которые под влиянием внутренних и внешних факторов меняют свои признаки. Если эти изменения связаны с генотипом, то они передаются по наследству и могут быть «подхвачены» естественным отбором. Когда новые признаки обеспечивают селективное преимущество данной популяции в сравнении с другими, то они отбором закрепляются. Тем самым меняется генофонд вида и осуществляется процесс эволюции.
Различают 2 категории изменчивости: фенотипическую (ненаследственную, модификационную) и генотипическую (наследственную), к которой относят мутации, рекомбинации, диссоциации, а также процессы репарации.
Фенотипическая изменчивость
Данный тип изменчивости является ненаследуемым. В этом случае возникают различия между организмами, одинаковыми по генотипу. Причиной их является постоянное воздействие на клетку изменяющихся факторов внешней и внутренней среды.
Изменения проявлений какого-либо признака или группы признаков микроорганизма получили названия модификаций. Они находятся под контролем генома, но не сопровождаются изменениями первичной последовательности ДНК. Основу модификации составляют репрессия или индуцибельный синтез соответствующих ферментов.
Модификационная изменчивость может быть обусловлена и альтернативной экспрессией генов. Примером является образование различных типов адгезинов у гонококка, необходимых для его связывания со слизистой оболочкой уретры. Данные белки выполняют одну и ту же функцию, но отличаются по антигенным свойствам. Это происходит в процессе инфекции за счет включения «молчащего» гена и выключения предыдущего. При этом каждая бактериальная клетка синтезирует только один тип адгезина. «Включение» различных генов, запуск процесса транскрипции могут быть обусловлены и изменением положения промоторных областей по отношению к соответствующим структурным генам.
При культивировании бактерий основными факторами фенотипической изменчивости являются особенности состава питательной среды (рH, концентрация солей и т.п.) и изменение самих условий культивирования (влажности, температуры и т.д.).
Модификации представляют собой временные изменения; они поддерживаются, пока действует неблагоприятный фактор и обеспечивают выживаемость организма в неблагоприятных условиях. Примером такой изменчивости является образование L-форм бактерий. Они представляют собой микроорганизмы, лишенные клеточной стенки. Чаще это результат действия химиотерапевтических веществ (например, пенициллина). Без антибиотика происходит постепенный возврат к исходному состоянию.
Выделяют 2 вида модификационной изменчивости:
а) стабильная или длительная модификация. Она сохраняется в потомстве в течение нескольких поколений;
б) кратковременная модификация – при исчезновении действующего фактора изменения исчезают также.
Такая изменчивость позволяет микробным популяциям быстро адаптироваться к факторам окружающей среды.
Генотипическая изменчивость
Мутации
Мутации – изменения структуры ДНК генов, проявляющиеся наследственно закрепленным изменением какого-либо признака или признаков. В природе они могут наступать спонтанно, без участия экспериментатора. Такие мутации относят к спонтанным. Они имеют свою причину, но не контролируются.
Индуцированные мутации – направленные изменения структуры ДНК, контролируемые экспериментатором.
Факторы, вызывающие мутации, называются мутагенами. Они могут быть химическим, физическими и биологическими.
Химические мутагены – соединения, способные изменять структуру генов, прямо взаимодействуя с ДНК клетки или реагируя с ферментами, контролирующими метаболизм нуклеиновых кислот. Известно огромное количество химических мутагенов – красители, галогены, соли металлов переходных валентностей (например – никеля), азотистый натрий, некоторые антибиотики и т.д.
К физическим мутагенам относятся такие факторы, как температура, гамма-излучение, ультрафиолетовые лучи, ренгеновские лучи и т.д.
К биологическим мутагенам можно отнести действие бактериофагов, накопление продуктов метаболизма и т.п.
По величине мутации делятся на генные – изменения в пределах 1 гена; хромосомные – изменения более, чем в одном гене, и точковые – в паре оснований нуклеотидов, что приводит к изменению одного триплета.
В случае точковых мутаций вместо одной аминокислоты кодируется другая или образуется бессмысленный кодон, не кодирующий аминокислоты. Последние мутации называются нонсенс-мутациями. Возможны молчащие мутации (без изменения смысла). Они возникают вследствие вырожденности генетического кода; образовавшийся в результате мутирования триплет кодирует ту же самую аминокислоту, что и исходный триплет. Миссенс-мутации(мутации с изменением смысла) – это результат изменения последовательности ДНК, ведущий к появлению в белковой цепи иной аминокислоты. Образующийся измененный белок может быть как активным, так и неактивным в зависимости от размеров мутации. Мутации со сдвигом рамки чтения обусловлены удалением или вставкой одного нуклеотида в ДНК, что приводит к «сдвигу» считывания и следовательно – к изменению всех последующих триплетов.
Мутации могут происходить вследствие замены одной пары оснований на другую (вместо гуанилового нуклеотида – цитидиловый, аденилового – тимидиловый или наоборот). В таких случаях часто бывают реверсии – возвращение структуры ДНК в исходное состояние. Также может быть включение дополнительной пары оснований (дупликация) или потеря (делеция) пары оснований. Реверсии обычно редки. Возникают также перемещения (транслокации) группы оснований или даже генов в пределах хромосомы. Здесь практически реверсий не бывает. Возможен поворот ДНК на 180 градусов – изменение ориентации сегмента ДНК (инверсия).
Могут возникать также структурные искажения ДНК (или мутации деформации спирали ДНК). Они могут возникать, например,в результате димеризации расположенных близко нуклеотидов, особенно тимина, под действием ультрафиолета, что препятствует правильной репликации.
Как уже упоминалось, мутации могут быть связаны и с подвижными элементами генома – с перемещением инсерционных последовательностей и транспозонов по хромосоме бактерии или из репликона в репликон (из хромосомы в плазмиду и наоборот). При транспозиции они могут вызывать делеции или инверсии генетического материала, а при включении в новый участок ДНК – дупликации.
По расположению мутации делятся на нуклеоидные и цитоплазменные (за счет плазмид).
По направлению выделяют прямые и обратные мутации
Прямые – это изменения бактерий «дикого» типа. «Дикий» тип представляет собой комплекс наследственных признаков клеток в естественных условиях обитания. Обратные мутации – это возврат от измененного типа к «дикому». Данный процесс может осуществляться и другим способом. Могут возникать мутации, подавляющие фенотипические проявления исходных (прямых) мутаций. Такие мутации называются супрессорными или вторичными.
По фенотипическим последствиям выделяют нейтральные мутации – фенотипически не проявляются; условно-летальные и летальные.
Мутации, которые ведут к изменению (обычно – ограничению), но не к исчезновению функциональной активности фермента, называют условно-летальными. Некоторые температурочувствительные мутанты сохраняют способность к синтезу ферментов, активных при 370С, но не способных к катализу при при 420С. У бактерий же дикого типа эти ферменты функционируют при обеих температурах.
Летальные мутации ведут к полной потере способности синтезировать жизненно важный фермент или ферменты, что ведет к гибели бактериальной клетки.
Мутации проявляются в фенотипе в виде утраты или изменения морфологических и биохимических признаков (например, жгутиков, пилей, капсулы, клеточной стенки; способности ферментировать какие-либо углеводы, синтезировать определенные аминокислоты, витамины и другие соединения, возникновении устойчивости к лекарственным или дезинфицирующим веществам и т.д.)
Оценку мутаций на молекулярном уровне проводят путем определения последовательности ДНК соответствующих генов (секвенирования). На клеточном уровне мутации выявляют по фенотипическим изменениям – по утрате или приобретению конкретного белка или изменению его функции (ферментативной или регуляторной активности). Для оценки мутаций на уровне популяции определяют частоту появления мутаций и проводят последующую селекцию измененных клеток в популяции для дальнейшего изучения.
У бактерий в результате мутаций могут меняться самые различные свойства: вирулентность, чувствительность к антибиотикам, биохимические свойства. Мутанты, нуждающиеся для своего развития в определенных ростовых факторах (аминокислотах, азотистых основаниях и т.д.), называются ауксогетеротрофными. Они не имеют ферментов для их синтеза и сохраняют жизнеспособность лишь при наличии в среде соответствующих факторов роста.
Диссоциация
Диссоциация – это особый, присущий только бактериям вид изменчивости, при котором происходит расщепление в пределах одного вида на S- и R-формы микроорганизмов. Это явление впервые исследовали Э.Вейльи А.Феликс (1917 г.).
В основу этого подразделения положены генетические перестройки, приводящие к изменению ряда свойств (культуральных, антигенных, биохимических). Так, S-формы (англ. smooth – гладкий) чаще вирулентны, обладают хорошо выраженными антигенными свойствами, имеют капсулу, на средах дают рост мелких блестящих колоний. R-формы (англ. rough – грубый, неровный) реже вирулентны, не имеют капсулы, колонии крупные, шероховатые.
Однако не у всех микробов S-форма свидетельствует о вирулентности. Так сибиреязвенные культуры, возбудители туберкулеза и чумы вирулентны в R-форме.
Диссоциация обычно протекает в одном направлении: от S- к R-форме, иногда через промежуточные стадии образования слизистых колоний.
Причиной диссоциации могут быть мутации, возникающие после встраивания внехромосомных факторов наследственности (эписом и умеренных фагов) в нуклеоид. Мутации сопровождают и процессы встраивания в нуклеоид транспозонов и инсерционных последовательностей. Если эти мутации нарушают функцию оперонов, которые отвечают за образование липополисахаридов клеточной стенки микроба, то образуются R-формы. Они дают шероховатые колонии, меняют антигенные свойства и ослабляют патогенность. Тем не менее, у дифтерийных бактерий S-R-диссоциация связана с их лизогенизацией бактериофагом; при этом R-формы образуют токсин, и их вирулентность резко увеличивается.
Значение диссоциации заключается в получении бактериями селективных преимуществ, обеспечивающих их существование в организме человека или во внешней среде. Например, S-формы более устойчивы к фагоцитозу. R-формы, в свою очередь, более устойчивы к факторам окружающей среды.
Репарации
Большинство изменений генетического кода, возникающих в результате мутаций, ведут к нарушению структуры и функции бактериальных клеток и часто являются летальными. Лишь небольшое количество из них является приспособительными и закрепляется отбором. Отсюда в процессе эволюции неизбежно возникли мощные механизмы, приводящие к восстановлению структуры поврежденной ДНК. Такие системы получили название репарационных, а сам процесс восстановления – репарации.
Эти системы состоят из многочисленных ферментов, контролирующих состояние ДНК.
Типичным примером репарационных систем является система фотореактивации. Она активизируется при образовании тиминовых димеров в ДНК под действием ультрафиолетового облучения. Ферменты, ответственные за фотореактивацию (в частности – фотолиаза), действуют в присутствии видимого света и деполимеризуют тиминовые димеры до исходных мономеров.
Аналогичная система, функционирующая в отсутствие видимого света, называется системой темновой репарации.
Существуетдорепликативная и пострепликативная репарация, которые отличаются по механизмам.
В случае дорепликативной репарации происходит выявление поврежденных участков и их эксцизия (вырезание) эндонуАклеазами с последующим удалением. Далее осуществляется синтез поврежденной цепи по матрице сохранившейся и сшивание участков ДНК-лигазой.
Пострепликативная репарация обеспечивается рекомбинационными процессами с замещением поврежденных участков.
Особое место в жизнедеятельности как отдельных бактериальных клеток, так и всей микробной популяции в целом занимает так называемая SOS-репарация или SOS-ответ.
SOS-ответ представляет собой индуцируемую реакцию клеток на резкую остановку синтеза нуклеиновых кислот, вызванную обширным повреждением ДНК, голоданием клетки или другими факторами. Это крайний ответ клетки на критическое состояние, приближающее ее к гибели. У Е. соli результатом SOS-ответа является индукция синтеза около 25 белков, имеющих прямое отношение к репарации, рекомбинации и синтезу ДНК.
Этот вид репарации у микробов контролируется так называемой SOS-областью (или SOS-регулоном). В норме эта область находится в репрессированном состоянии и активируется лишь в критические для клетки моменты. Возникает взрыв генетических процессов – возрастает частота мутаций как точечных, так и по типу сдвига рамки считывания, увеличивается частота хромосомных перестроек, активируются специализированные системы делеции ДНК, возрастает частота рекомбинационных обменов, и наконец, становится возможной запрещенная межвидовая рекомбинация.
Задача SOS-индуцированного мутагенеза – заставить ДНК-полимеразу пройти повреждение даже ценой ошибки.
SOS-ответ имеет весьма важное значение для развития микробной популяции в целом. К настоящему времени уже выяснено, что и эволюция генома, и шоковая адаптация популяции к изменившимся внешним условиям происходит не только путем постепенного накопления необходимого числа мутаций для получения нового признака. Лишь горизонтальный (в том числе – межвидовой) перенос блоков, составляющих гены, или даже целых генов, может обеспечить моментальное приобретение нужного качества.
В природной популяции Е. соli до 1% клеток имеют мутантный фенотип. Таково условие выживания данной популяции. В благоприятных же искусственных условиях число клеток-мутантов снижается на несколько порядков. Отсюда для постоянно идущего процесса эволюционной изменчивости более выгодны стрессовые ситуации, предусматривающие, в частности, межвидовой обмен генетическим материалом. Это и обеспечивает индуцибельная система SOS.