Раздел vi. б и о х и м и я к р о в и

Занятие № 17

ТЕМА: БЕЛКИ ПЛАЗМЫ КРОВИ. МЕТОДЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

Цель занятия: 1.Знать основные белки плазмы крови, их функции и особенности структуры.

2.Ознакомиться с методами разделения белков.

Исходный уровень знаний:

- структура и биологическая роль белков;

- классификация белков;

- различие альбуминов и глобулинов;

- энзимодиагностика.

Содержание занятия.

I.2. Физиологическая роль белков плазмы крови.

Характеристика отдельных белков. Понятие о нормо-, гипо- и гиперпротеинемии.

Диспротеинемии, парапротеинемии, дефектопротеинемии.

Эмбриоспецифические белки.

II.1.Работа № 1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО БЕЛКА

БИУРЕТОВЫМ МЕТОДОМ

Принцип метода.

Метод основан на образовании окрашенного в фиолетовый цвет комплекса пептидных связей белка с ионами двухвалентной меди (сульфата меди) в щелочной среде (биуретовый комплекс). Интенсивность окраски раствора пропорциональна концентрации белка в сыворотке и определяется фотометрически.

Порядок выполнения работы:

Реактивы (мл)	Опытная пробирка	Контрольная пробирка
Биуретовый реактив
Сыворотка крови (взять микропипеткой)	0,1	-
0,9% раствор NaCl	-	0,1

Осторожно перемешать, оставить на 30 минут в штативе при комнатной температуре.

Фотоколориметрировать при зеленом светофильтре 540 нм против контрольного раствора. Определив экстинкцию исследуемого раствора, найти по графику, какой концентрации белка (в г/л) она соответствует.

РЕЗУЛЬТАТ:

ВЫВОД:

Клинико-диагностическое значение.

Нормальное содержание общего белка в сыворотке крови у взрослых 65-85 г/л (6,5-8,5 г%), у детей до 6 лет - 56-85 г/л (5,6-8,5г%).

Повышение содержания белка (гиперпротеинемия) наблюдается при ревматизме и миеломной болезни (плазмоцитоме) - до 120-150 г/л. Кратковременная относительная гиперпротеинемия отмечается при сгущении крови из-за значительных потерь жидкости, например, при усиленном потоотделении, неукротимой рвоте, профузных поносах, несахарном диабете, холере, тяжелых ожогах.

Понижение уровня белка (гипопротеинемия) имеет место при нефритах, злокачественных опухолях, алиментарной дистрофии.

Работа № 2. ТИМОЛОВАЯ ПРОБА.

Принцип метода.

Патологически повышенные b-глобулины, g-глобулины и липопротеиды осаждаются из сыворотки крови насыщенным тимолом. Измеряют интенсивность помутнения, зависящую от содержания белковых фракций и их количественных соотношений.

Порядок выполнения работы

Реагенты (мл)	Проба	Раствор сравнения
Рабочий раствор	3,0	3,0
Сыворотка крови (микропипеткой)	0,05	-
Физиологический раствор	-	0,05

Перемешать и выдержать точно 30 минут при комнатной температуре, после этого вновь перемешать и измерить оптическую плотность пробы против раствора сравнения в 1 см кювете при длине волн 650 нм (светофильтр № 4).

РЕЗУЛЬТАТ:

ВЫВОД:

Клинико-диагностическое значение.

Нормальные величины: 0-4 единиц S-H (единицы помутнения по Shank-Hoagland). Повышение тимоловой пробы наиболее характерно для заболеваний печени (ещё до появления желтухи). Патологические величины - более 5 единиц S-H.

Работа № 3. ПРОБА ВЕЛЬТМАНА

Принцип метода.

При добавлении к сыворотке раствора хлорида кальция и нагревании происходит нарушение коллоидальной устойчивости сыворотки.

Порядок выполнения работы.

К 0,1 мл сыворотки прибавить 4,9 мл воды, перемешать, опрокидывая пробирку, и прибавить 0,1 мл 0,5% раствора хлорида кальция. Встряхивать и нагревать пробирку над пламенем до однократного закипания смеси. Охладить пробирку и осмотреть на свету. Если хлопьев нет, то в эту же пробирку добавить еще 0,1 мл хлорида кальция и вновь прокипятить. Процедуру повторить, пока не выпадут хлопья.

Результаты оценить, подсчитав общее количество пошедшего на реакцию хлорида кальция.

РЕЗУЛЬТАТ:

ВЫВОД:

Клинико-диагностическое значение.

В норме коагуляция наступает при прибавлении 0,4-0,5 мл раствора хлорида кальция. Проба Вельтмана снижена при паренхиматозном поражении печени и малярии. Коагуляция при добавлении большего количества раствора хлорида кальция наблюдается при ревматизме, туберкулезе легких.

Все последующие работы демонстрируются преподавателем.

Работа № 4. РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ

В АГАРЕ ПО ОУХТЕРЛОНИ

Принцип метода.

При встречной диффузии в агар молекулы антигена и антител реагируют между собой, образуя преципитат. Линия преципитации становится видимой в проходящем луче света, если реагирующие компоненты находятся в оптимальном соотношении. С помощью этого метода можно провести анализ антигенной смеси, т.к. каждая пара антиген-антитело образует свою линию преципитации, и сравнить антигенные компоненты в различных системах.

Рис. 4. Полуколичественный учет результатов анализа. 1- антисыворотка, 2 -тест-антиген, 3-10 - последовательное разведение исследуемой пробы: 1/1, 1/2, 1/4, и т.д. до 1/128.

Работа № 5. РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ МЕТОДОМ

ЭЛЕКТРОФОРЕЗА НА БУМАГЕ, В АГАРОВОМ И В

ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЯХ

Принцип метода.

Молекулы белков обладают свободным электрическим зарядом, величина которого и знак зависят от соотношения основных и кислых ионизированных групп в молекуле. Под влиянием внешнего электрического поля заряженные молекулы белка передвигаются в растворе к противоположно заряженному полюсу. Разделение смеси белков на отдельные фракции происходит в результате различия относительной молекулярной массы и зарядов молекул белков, которые перемещаются в электрическом поле неодинаково. Скорость передвижения белковых молекул пропорциональна величине их свободного заряда и обратно пропорциональна размеру частиц и степени их гидратации. Электрофоретическое разделение белков широко используется как для диагностики заболеваний, так и для препаративных целей.

Рис. 5а. Разделение сыворотки крови человека с помощью электрофореза в геле агарозы и кривые, полученные при денситометрическом измерении электрофореграмм.

Нормальная сыворотка (А) и сыворотки больных с множественной миеломой (Б), циррозом печени (В) и нефротическим синдромом (Г).

Рис.5б. Разделение белков сыворотки крови в полиакриламидном

геле с линейным градиентом концентраций в пределах 4-30%.

Работа № 6. РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ

МЕТОДОМ ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗА

Принцип метода.

Иммуноэлектрофорез впервые был предложен Грабарем и Уильямсом в 1953 году и представляет собой комбинацию электрофоретического разделения белков с последующей иммунопреципитацией в геле, что значительно повышает чувствительность метода. С помощью иммуноэлектрофореза можно провести анализ антигенной смеси, качественное и количественное определение известного антигена. Так, например, в сыворотке крови здорового взрослого человека данным методом можно выделить более 30 различных белковых фракций. В зависимости от поставленных целей можно использовать различные варианты иммуноэлектрофореза.

а)

б)

Траншея с антителами

Рис. 6. 1. Принцип иммуноэлектрофореза:

а) электрофорез белков сыворотки крови; б) иммунодиффузия с образованием индивидуальных линий преципитации на каждый вид антигенов.

2. Иммуноэлектрофореграмма сывороточных белков (негатив).

III.2. Контрольные вопросы.

Укажите содержание общего белка в сыворотке крови

в норме.

В каких случаях отмечается гиперпротеинемия?

В каких случаях отмечается гипопротеинемия?

Укажите нормальные показатели тимоловой пробы.

При каких заболеваниях повышаются результаты тимоловой пробы?

Чему в норме равны значения пробы Вельтмана?

При какой патологии происходит повышение показателей пробы Вельтмана?

Какая патология сопровождается понижением показателей пробы Вельтмана?

Назовите основные фракции белков крови на электрофореграмме.

Перечислите иммунохимические методы определения белков.

Объясните основной принцип иммунохимических методов.

Материал для самоподготовки: I а)1. с.567-578; II; III.

Занятие № 18.

ТЕМА. СВЁРТЫВАНИЕ КРОВИ И ФИБРИНОЛИЗ

Цель занятия: 1.Ознакомиться с современными представлениями о свёртывании крови.

2.Знать роль основных факторов свёртывающей системы.

3.Усвоить природу противосвёртывающей системы крови.

4.Ознакомиться с методами определения фибриногена.

Исходный уровень знаний:

- структура и биологическая роль белков;

- классификация белков;

- каталитическая функция белков;

- кровь: химический состав, физико-химические характеристики, функции;

- форменные элементы крови;

- отличие плазмы крови от сыворотки.

Содержание занятия.

I.2. Плазменные факторы свёртывания крови: место синтеза, строение, функция.

Тромбоцитарные факторы свёртывания: название, функция.

"Внешний" и "внутренний" пути активации свёртывающей системы крови.

Схема фибринолиза.

Лекарственные препараты, используемые для лечения и профилактики тромбозов.

Гемофилии: природа, способы лечения.

II.1 Работа № 1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ФИБРИНОГЕНА ГРАВИОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ

(по Рутбергу Р.А.)

Принцип метода. При добавлении к плазме раствора хлористого кальция происходит свертывание фибриногена и выпадение его в осадок.

Количество выпавшего в осадок фибриногена определяют путем взвешивания сгустка на торсионных весах.

Порядок выполнения работы. В пробирку внести 1 мл плазмы и добавить 0,1 мл 5% раствора хлористого кальция. Пробирку встряхнуть и оставить в термостате при температуре 37⁰С на 15 минут. Образовавшийся фибриновый сгусток отжать на фильтровальной бумаге до исчезновения следов влаги. Отжатый сгусток взвесить на торсионных весах с точностью до 1 мг. Полученный результат умножить на коэффициент 0.222. Количественный результат выражается в граммах на 1 литр плазмы.

РЕЗУЛЬТАТ:

ВЫВОД:

Клинико-диагностическое значение.

У здоровых людей концентрация фибриногена в плазме колеблется в пределах 2 - 4 г/л. Значительное повышение концентрации фибриногена отмечается при системных заболеваниях соединительной ткани и острых воспалительных процессах. Снижение обусловлено, в первую очередь, нарушением синтеза при заболеваниях печени и потреблением в большом количестве при ДВС синдромах.

Работа № 2. МИКРОМЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ

ФИБРИНОГЕНА ВВ ПЛАЗМЕ

Принцип метода. Спиртовый раствор b-нафтола осаждает из плазмы фибрин-мономеры и их комплексы с фибринопептидами А и В, фибриногеном.

Порядок выполнения работы. В центрифужную пробирку внести 0.5 мл. плазмы и добавить 2 капли 2% раствора b-нафтола. Пробирку встряхнуть и оставить в штативе при комнатной температуре на 10 минут. При наличии в плазме фибриногена В в пробирке образуется сгусток, нити или гранулы.

Клинико-диагностическое значение.

В норме фибриноген В в крови не определяется. Появление фибриногена В в плазме обусловлено патологическим нарастанием уровня тромбина в крови, поэтому положительная реакция на фибриноген В имеет большое значение для диагностики пред- и тромботических состояний, ДВС-синдромов.

РЕЗУЛЬТАТ:

ВЫВОД:

III.2. Контрольные вопросы.

Какова концентрация фибриногена в плазме крови у здоровых людей?

Укажите причины гиперфибриногенемии, гипофибриногенемии.

Когда в плазме определяется фибриноген В?

Материал для самоподготовки: I а)1. с. 599-607; II; III.