Реакция агглютинации, механизм, методы постановки, применение.

Реакция агглютинации — простая по постановке реакция, при которой происходит связыва­ние антителами корпускулярных антигенов (бактерий, эритроцитов или других клеток, нерастворимых частиц с адсорбированными на них антигенами, а также макромолекулярных агрегатов). Она протекает при наличии электролитов, например при добавлении изо­тонического раствора натрия хлорида.

Применяются различные варианты реакции агглютинации: развернутая, ориентировоч­ная, непрямая и др. Реакция агглютинации проявляется образованием хлопьев или осад­ка (клетки, «склеенные» антителами, имеющими два или более антигенсвязывающих центра — рис. 13.1). РА используют для:

1) определения антител в сыворотке крови боль­ных, например, при бруцеллезе (реакции Райта, Хеддельсона), брюшном тифе и паратифах (реак­ция Видаля) и других инфекционных болезнях;

2) определения возбудителя, выделенного от больного;

3) определения групп крови с использова­нием моноклональных антител против аллоантигенов эритроцитов.

Для определения у больного антител ставят развернутую реакцию агглютинации:к разве­дениям сыворотки крови больного добавля­ют диагностикум (взвесь убитых микробов,) и через несколько часов инкубации при 37 ˚С отмечают наибольшее разведение сыворотки (титр сыворотки), при котором произошла агглютинация, т. е. образовался осадок.

Характер и скорость агглютинации зави­сят от вида антигена и антител. Примером являются особенности взаимодействия диагностикумов (О- и H-антигенов) со специ­фическими антителами. Реакция агглютина­ции с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие термостабильный О-антиген) происходит в виде мелкозернис­той агглютинации. Реакция агглютинации с Н-диагностикумом (бактерии, убитые фор­малином, сохранившие термолабильный жгу­тиковый Н-антиген) — крупнохлопчатая и протекает быстрее.

Если необходимо определить возбудитель, выделенный от больного, ставят ориентиро­вочную реакцию агглютинации,применяя диа­гностические антитела (агглютинирующую сыворотку), т. е. проводят серотипирование возбудителя. Ориентировочную реакцию проводят на предметном стекле. К капле диа­гностической агглютинирующей сыворотки в разведении 1:10 или 1:20 добавляют чистую культуру возбудителя, выделенного от больно­го. Рядом ставят контроль: вместо сыворотки наносят каплю раствора натрия хлорида. При появлении в капле с сывороткой и микроба­ми хлопьевидного осадка ставят развернутую реакцию агглютинации в пробирках с увели­чивающимися разведениями агглютинирую­щей сыворотки, к которым добавляют по 2—3 капли взвеси возбудителя. Агглютинацию учитывают по количеству осадка и степени просветления жидкости. Реакцию считают положительной, если агглютинация отмеча­ется в разведении, близком к титру диагнос­тической сыворотки. Одновременно учитыва­ют контроли: сыворотка, разведенная изото­ническим раствором натрия хлорида, должна быть прозрачной, взвесь микробов в том же растворе — равномерно мутной, без осадка.

Разные родственные бактерии могут агглютинироваться одной и той же диагностической агглютинирующей сывороткой, что затрудня­ет их идентификацию. Поэтому пользуются адсорбированными агглютинирующими сыво­ротками, из которых удалены перекрестно реагирующие антитела путем адсорбции их родственными бактериями. В таких сыво­ротках сохраняются антитела, специфичные только к данной бактерии.

120. Реакция агглютинации для определения антител.

Агглютинация — это склеивание и выпадение в осадок микроорганизмов или других клеток (корпускулярных антигенов) под действием специфических антител в присутствии электролитов.

РА применяется для серологической диагностики инфекционных заболеваний (реакция Видаля — при брюшном тифе и паратифах, р. Вейгеля — при эпидемическом сыпном тифе, р. Райта — при бруцеллезе и др.) и для серологической идентификации микробов.
В РА участвуют 3 ингредиента:
1) корпускулярный АГ (агглютиноген);
2) антитело (агглютинин);
3) изотопический раствор хлорида натрия (электролит).
Антигены — взвесь живых и убитых микроорганизмов.
Идентификацию вида (серотила) микроба, выделенного от больного или внешней среды, определяют по известному антителу (диагностической иммунной сыворотки). Положительный результат реакции укажет на то, что неизвестный микроб идентичен тому, который был взят в качестве антигена для приготовления иммунной диагностической сыворотки.

Для приготовления взвеси испытуемого микроорганизма суточную агаровую культуру бактерий смывают 1-2 мл физиологического раствора, доводя концентрацию до 2-х млрд. микробных клеток в 1 мл.

При определении неизвестных антител в сыворотке крови больного или реконвалесцента принято пользоваться заранее заготовленными диагностикумами — микробами, убитыми формалином, спиртом, прогреванием, которые готовятся в производственных условиях.

При лабораторной диагностике некоторых инфекционных заболеваний, например, брюшного тифа и паратифов, имеет значение раздельное определение О- и Н-антител в исследуемых сыворотках, т.к. время их появления у больных и сохранение у реконвалесцентов различно. Для этих исследований необходимо располагать соответственно О- и Н-диагностикума-ми. Для приготовления жгутикового Н-антигена к взвеси агаровой культуры микробов в физиологическом растворе добавляют 0,2 % формалина и выдерживают при 37 °С в течение 24 часов О-диагностикум получают прогреванием пробирки со смывом агаровой культуры соответствующего микроба в кипящей водяной бане в течение 1,5-2 часов.

Антитела (сыворотки):
а) Испытуемая сыворотка от больного или реконвалесцента получается из крови, взятой стерильно из локтевой вены в количестве 1-2 мл в стерильную пробирку; оставляют на 1 час при комнатной температуре или при 37 °С на 30 минут. Образовавшийся сгусток отделяют от стенок пробирки бакпетлей, затем пробирку оставляют в холодильнике на ночь. Кровь цен-грифугируют и отсасывают сыворотку.

Готовят последовательно, чаще двукратные разведения сыворотки. Обычно разводят в соотношении от 1:50 до 1 800.

Количество неизвестных агглютинирующих антител в сыворотке оценивается по титру — наибольшему разведению сыворотки, которое еще дает реакцию агглютинации (выпадение осадка — агглютинат).

Существует два основных метода постановки РА:
1) ориентировочная РА на предметном стекле, наступающая в течение нескольких минут. Применяется только с целью идентификации вида (серотипа) выделенной из организма больного чистой культуры по его специфичности как АГ к серотипу АТ;
2) развернутая РА в пробирках, которая учитывается через 2 часа выдерживания при 37 «С и на следующий день стояния при комнатной температуре. Применяется с целью идентификации микроба и обнаружения АТ в сыворотке крови.

РА входит в группу методов, в которых реакция протекает в две фазы:
1) соединение АГ с АТ (специфическая фаза)
2) выпадение образовавшегося комплекса АГ-АТ (агглю-тината) в растворе солей (электролите) в осадок (неспецифическая фаза).

Антигены поливалентны, а антитела — двух (ИгО) или более (ИгМ) валентны. Соединение их приводит к образованию макроконгломератов, выпадающих в осадок. Причем характер осадка зависит от свойств антигена: жгутиковые бактерии, имеющие Н-АГ. склеиваются жгутиками, при этом образуются крупнохлопчатый осадок^ который наступает а течение двух часов при 37 «С, У безжгутиковых бактерий, имеющих соматический О-АГ, происходит склеивание непосредственно самих клеток и образование мелкозернистого осадка. Такой осадок образуется медленно, в течение 18-24 часов при комнатной температуре.

Достоинства РА: простота постановки и экспрессность.
Недостатки: уступает по специфичности и чувствительности.

121. Реакция агглютинации для определения антигена (возбудителя). Монорецепторные сыворотки, методы их получения.

Реакция агглютинации основана на специфическом взаимодействии антител (агглютининов) с целыми микробными или другими клетками. В результате такого взаимодействия образуются частицы-агломераты, выпадающие в осадок (агглютинат). В реакции агглютинации могут участвовать бактерии, простейшие, грибы, дрожжи, риккетсии, эритроциты и другие клетки, как живые, так и убитые. Протекает реакция в две фазы: первая — специфическое соединение антигена и антитела, вторая — кеспецифическая, т. е. образование видимого агглютината. Выпадение агглютината происходит в присутствии электролитов, например хлорида натрия. Находящиеся в агглютинате микроорганизмы остаются живыми, но теряют подвижность.
Реакцию агглютинации широко применяют для серологической диагностики инфекционных заболеваний и определения антигенной структуры выделенных микробов. Для установления антигенной структуры возбудителя, выделенного из организма больного или носителя, используют специфическую иммунную сыворотку, полученную иммунизацией животных (кролика, осла, барана) определенными микроорганизмами. Идентификацию микроба проводят в реакции агглютинации на стекле с адсорбированными или монорецепторными сыворотками или в пробирках с видовыми агглютинирующими сыворотками. Адсорбированные сыворотки содержат антитела только к специфическим для данного микроба антигенам, а монорецепторные — только к одному специфическому антигену возбудителя. Видовые сыворотки содержат антитела ко всем антигенам определенного микроба.

Кастеллани предложил метод адсорбции групповых антител из иммунных сывороток, основанный на удалении их с помощью микроорганизмов родственных видов, которые имеют групповые антигены, но лишены специфических. Культура таких микроорганизмов, добавленная в сыворотку, адсорбирует неспецифические групповые антитела, и после удаления комплекса антиген — антитело с помощью центрифугирования в сыворотке остаются только специфические иммуноглобулины. Сыворотки, обработанные по методу Кастеллани, могут быть использованы в реакции агглютинации как высокоспецифичные.

В диагностике инфекционных болезней широко применя­ются иммунные реакции при идентификации возбудителя: при установлении родовой, видовой и типовой принадлежности микроба (вируса). Для постановки таких реакций необходимы специфические диагностические сыворотки, которые в зависи­мости от содержания соответствующих антител называются агглютинирующие, преципитирующие, гемо­литические, противовирусные.

Агглютинирующие сыворотки. Агглютинирующую сыворотку получают иммунизацией кроликов (внутривенно, подкожно или внутрибрюшинно) взвесью убитых бактерий, начиная с дозы 200 млн., затем 500 млн., 1 млрд., 2 млрд., микробных тел в 1 мл, с интервалами 5 дней. Через 7—8 дней после последней иммунизации берут кровь и определяют титр антител. Титром агглютинирующей сыворотки называется то макси­мальное разведение сыворотки, при котором происходит агглютинация с соответствую­щим микроорганизмом.

Агглютинирующие сыворотки применяются при идентифи­кации микроба в развернутой реакции агглютинации. Если изучаемый микроорганизм агглютинируется сывороткой до титра или до половины значения титра, его можно считать принадлежащим к тому виду, название которого указано на этикетке ампулы.

Неадсорбированные агглютинирующие сыворотки облада­ют высоким титром — до 1 : 12 800 — 1 : 25 600.

Недостатком таких сывороток является то, что они способ­ны давать групповые реакции агглютинации, так как они содержат антитела к бактериям, имеющим общие антигены в пределах семейства, группы и рода.

Поэтому в настоящее время большинство агглютинирую­щих сывороток выпускаются адсорбированными, монорецепторными и адсорбированными поливалентными, содер­жащими только типовые или видовые антитела и соответст­вующими или определенному типу или виду микроорганизма. Эти сыворотки не подлежат разведению.

Для получения таких сывороток применяют метод Кастелляни — метод адсорбции, который состоит в том, что при насыщении агглютинирующей сыворотки родственны­ми гетерогенными бактериями происходит адсорбция групповых антител, а специфические антитела остаются в сыворот­ке. В зависимости от полноты истощения групповых агглюти­нинов можно получить монорецепторные сыворотки — сыво­ротки, имеющие антитела только к одному рецептору-антигену или адсорбированные, поливалентные, дающие реакции агглю­тинации с двумя — тремя родственными бактериями, имею­щими общий антиген, в отношении которого проводилась ад­сорбция.

Адсорбированные сыворотки применяют при идентифика­ции выделенных возбудителей в реакции агглютинации на стекле (пластинчатый метод).

Агглютинирующие сыворотки наиболее широко применя­ются при диагностике заболеваний, вызываемых бактериями семейства Enterobacteriaceae. Так, при идентификации эшерихий используются поливалентные и типовые ОК-сыворотки; при дифференциации сальмонелл — набор сывороток: агглю­тинирующая адсорбированная поливалентная сальмонеллезная О-сыворотка (групп А, В, С, Д, Е) — для определения принадлежности к роду Salmonella, при положительном ре­зультате — определяют отдельно с каждой сывороткой (входя­щей в смесь) серологическую группу и в заключение опреде­ляется серологический тип выделенного возбудителя с моно-рецепторными Н-сыворотками сальмонелл, входящих в данную группу.