Реакция преципитации. Определение, виды

Реакция преципитации (РП)(лат. praecipito ¾осаждать) ¾ это формирование и осаж­дение комплекса растворимого молекулярно­го антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эк­вивалентных количествах; избыток одного из них снижает уровень образования видимого иммунного комплекса.

Реакции преципитации ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, пита­тельных средах и др. Широкое распростране­ние получили разновидности реакции преци­питации в полужидком геле агара или агарозы: двойная иммунодиффузия по Оухтерлони, радиальная иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез и др.

Реакция кольцепреципитации.Реакцию про­водят в узких преципитационных пробирках с иммунной сывороткой, на которую наслаивают растворимый антиген. При оптимальном соот­ношении антигена и антител на границе этих двух растворов образуется непрозрачное кольцо преципитата. Избыток антигена не влияет на результат реакции кольцепреципи­тации вследствие постепенной диффузии ре­агентов к границе жидкости. Если в качестве антигенов в реакции кольцепреципитации ис­пользуют прокипяченные и профильтрованные водные экстракты органов или тканей, то такая реакция называется реакцией термопреципита­ции (реакция Асколи, при сибирской язве).

Реакция двойной иммунодиффузии по Оухтерлони.Для постановки реакции расплавленный агаровый гель тонким слоем выливают на стеклянную пластинку и после его затверде­вания в нем вырезают лунки размером 2-3 мм. В эти лунки раздельно помешают антигены и иммунные сыворотки, которые диффундируют навстречу друг другу. В месте встречи в эквива­лентных соотношениях они образуют преципи­тат в виде белой полосы. У многокомпонентных систем между лунками с разными антигенами и антителами сыворотки появляется несколько линий преципитата; у идентичных антигенов линии преципитата сливаются; у неидентич­ных — пересекаются.

Реакция радиальной иммунодиффузии.Иммунную сыворотку вносят в расплавленный ага­ровый гель и равномерно наливают на стекло. После застывания в геле делают лунки, в кото­рые помещают антиген в различных разведе­ниях. Антиген, диффундируя в гель, образует с антителами кольцевые зоны преципитации вок­руг лунок. Диаметр кольца преципи­тации пропорционален концентрации антигена. Реакцию используют для определения содержа­ния в крови иммуноглобулинов различных клас­сов, компонентов системы комплемента и др.

Иммуноэлектрофорез— сочетание метода электрофореза и иммунопреципитации: смесь антигенов вносится в лунки геля и разделяет­ся в геле с помощью электрофореза. Затем в канавку параллельно зонам электрофореза вносят иммунную сыворотку, антитела кото­рой, диффундируя в гель, образуют в месте «встречи» с антигеном линии преципитации.

Реакция флоккуляции(по Рамону) (лат. floccus — хлопья шерсти) ¾ появление опалесценции или хлопьевидной массы (иммунопреципитации) в пробирке при реакции ток­син ¾ антитоксин или анатоксин ¾ антитоксин. Ее применяют для определения активности антитоксической сыворотки или анатоксина.

2. Реакция связывания комплемента (РСК): этапы реакции, методика определения рабочей дозы комплемента, подготовка гемолитической системы

Реакция связывания комплемента (РСК)за­ключается в том, что при наличии специфичности антигены и антитела образуют иммун­ный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент, то есть происходит связывание комплемента комп­лексом антиген-антитело. Если же комплекс антиген-антитело не образуется, то комп­лемент остается свободным. РСК проводят в две фазы: 1-я фаза ¾ инкубация смеси, содержащей три компонента: антиген, антитело и комплемент; 2-я фаза (инди­каторная) — выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемоли­тической системы, состоящей из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, содер­жащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген-антите­ло (специфичности антигена и антител) происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизирован­ных антителами эритроцитов не произойдет, реакция считается положительной. Если специфичность антигена и ан­тител не соответствуют друг другу, то комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит-антиэритроцитарное антитело, вызывая гемо­лиз, реакция считается отрицательной. РСК применяют для диагностики многих инфекционных болезней, в частности риккетсиозов, гонореи, коклюша, сифи­лиса (реакция Вассермана).

3. Реакции нейтрализации

Антитела иммунной сыворотки способны нейтрализовать повреждающее действие мик­робов или их токсинов на чувствительные клетки и ткани, что связано с блокадой мик­робных антигенов антителами, т. е. их нейтра­лизацией. Реакцию нейтрализации (РН) прово­дят путем введения смеси антиген-антитело животным или в чувствительные тест-объекты (культуру клеток, эмбрионы). При отсутствии у животных и тест-объектов повреждающего действия микроорганизмов или их антигенов, токсинов говорят о нейтрализующем дейс­твии иммунной сыворотки и, следовательно, о специфичности взаимодействия комплекса антиген-антитело.

III. План практической работы

1. Изучить технику постановки и учесть реакцию преципитации (РП) в геле с целью определения токсигенности дифтерийной палочки (РН токсина антитоксической сывороткой).

Полоску фильтровальной бумаги, пропитанной антитоксической противодифтерийной сывороткой, накладывают на поверхность прозрачного агара в чашке Петри. Культуры дифтерийной палочки сеют бляшками на расстоянии 0,6-0,8 см от полоски фильтровальной бумаги и 1-1,5 см друг от друга. Исследуемые и контрольную (токсигенную) культуры дифтерийной палочки чередуют с одной стороны полоски фильтровальной бумаги, а напротив, с другой стороны полоски сеют одноименные культуры (дубли). Чашку инкубируют при 37ºС в течение 24-48 часов. Затем проводят учет. Положительной реакция считается при наличии тонкой линии преципитата между полоской фильтровальной бумаги и ростом бактерий в виде бляшки, отрицательной ¾ при её отсутствии. Реакция считается специфичной, если контрольная культура дала положительный результат.

2. Поставить и учесть реакцию кольцепреципитации Асколи в диагностике сибирской язвы (с целью обнаружения антигенов возбудителя сибирской язвы в исследуемом материале).

Из органов трупа животного (селезенки, участков воспаления и геморрагий кишечной стенки, легких) готовят термоэкстракт, путем кипячения в изотоническом растворе хлорида натрия и фильтрования, возможно содержащий термостабильный антиген возбудителя сибирской язвы. Реакцию ставят в узких преципитационных пробирках, внося равные объемы (0,3-0,5 мл) каждого компонента, причем второй компонент реакции осторожно наслаивают на первый, наклоняя пробирку под углом 45º. Реакция ставится согласно схеме (таблица).

Ингредиенты	Рабочая пробирка	Отрицательный контроль сыворотки	Положительный контроль сыворотки	Контроль термоэкстракта
Исследуемый материал (термоэкстракт из органов животного)	+			+
Диагностикум (стандартный сибиреязвенный антиген)			+
Преципитирующая сибиреязвенная сыворотка (на дно)	+	+	+
Нормальная сыворотка животного (на дно)				+
Изотонический раствор NaCl		+

В случае наличия антигенов возбудителя сибирской язвы втермоэкстрактена границе между жидкостями появляется мутно-белое кольцо преципитата не позднее, чем через 15 минут.

3. Изучить схему постановки и учесть РСК в серодиагностике сыпного тифа.

Реакция связывания комплемента (РСК) ¾ это сложная многокомпонентная серологическая реакция, в которой используются две системы AГ- AT (исследуемая и индикаторная) и комплемент в рабочей дозе.

Первую систему называют исследуемой или тест-системой, она содержит один неизвестный компонент (исследуемая сыворотка, в которой определяется наличие антител) и известный компонент (диагностикум). Вторую систему называют индикаторной или гемолитической (эритроциты барана + антитела сыворотки кролика). РСК проходит в два этапа:

1) тест-система (№1) + комплемент ¾ 1 час инкубации при 37ºС

2) добавляют гемолитическую систему (№ 2) ¾ 1 час инкубации при 37ºС

РСК имеет много компонентов, поэтому ставят несколько контролей. Все компоненты используют в эквивалентных количествах. Постановке основного опыта РСК предшествует титрование комплемента для определения его рабочей дозы, так как при этой реакции необходимо точное соблюдение количественных соотношений ингредиентов.

Титрование комплемента

Из коммерческого препарата комплемента, представляющего собой лиофилизированную сыворотку крови морской свинки, готовят разведения 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35 и 1:40. К 0,2 мл каждого разведения комплемента добавляют по 0,4 мл гемолитической системы (смесь равных объемов 3% суспензии эритроцитов барана в изотоническом растворе хлорида натрия и гемолитической сыворотки кролика в тройном титре после их инкубации в течение 30 минут). После инкубации пробирок 30 минут при 37ºС определяют титр комплемента — наибольшее его разведение, которое вызывает полный лизис эритроцитов в гемолитической системе. В реакции РСК используют рабочую дозу комплемента, которая на 25% больше, чем титр комплемента.