Методы экспериментального изучения опухолей
Основными, ставшими классическими, методами изучения опухолевого роста в эксперименте являются: 1) трансплантация, 2) индукция, 3) эксплантация, 4) выведение раковых линий животных и животных с наследственной предрасположенностью к опухолям.
Трансплантация (пересадка, перевивка) опухоли впервые успешно была осуществлена от взрослых собак щенкам отечественным учёным М.А. Новинским в 1876 году в Санкт-Петербурге. Наряду с аутотрансплантацией (перевивкой опухоли из одного места тела животного в другое), изотрансплантацией (перевивкой опухоли от одного животного к другому той же линии) и аллотрансплантацией или гомотрансплантацией (перевивкой опухоли от одного животного другому того же вида), в последние годы чаще используют гетеротрансплантацию (перевивку опухоли от одного вида организма другому виду, например, от человека животному). Для повышения эффективности гетеротрансплантации используют животных-реципиентов с подавленным иммунитетом. Для этого применяется общее рентгеновское облучение, введение кортикостероидов, цитостатиков, антилимфоцитарной сыворотки, удаление тимуса.
Трансплантация опухоли является удобным методом для оценки опухолевой прогрессии, изучения влияния опухоли на организм и, особенно, оценке методов и средств лечения конкретных видов опухоли.
Индукция опухолей обычно осуществляется при помощи введения здоровым животным либо вирусов, либо химических канцерогенов.
Модель вирусного канцерогена была впервые, в 1908 году, воспоизведена Эллерманом и Бангом в опытах на курах путём перевивки лейкоза с помощью бесклеточного фильтрата (содержащего вирусы). Затем, в 1911 году, перевивку саркомы также с помощью бесклеточного фильтрата в опытах на курах произвёл Роус. В дальнейшем была доказана способность многих и ДНК-, и РНК-содержащих вирусов вызывать различные опухоли у разных видов животных.
Модель локального химического канцерогенеза была впервые, в 1915 году, воспроизведена Ямагива и Ишикава в опытах на кроликах путём длительного (шестимесячного) втирания в кожу уха кролика каменноугольной смолы. В дальнейшем разными учёными разработаны методики индукции опухолей не только многократным, но даже однократным парентеральным введением химических канцерогенов.
Индукция опухолей широко используется во всём мире для оценки характера и степени канцерогенного действия различных химических, в том числе и лекарственных, веществ и соединений.
Эксплантация опухоли осуществляется путём помещения опухолевых клеток (срезов опухолей или клеточных культур) в искусственную питательную среду (то есть in vitro) на различный период времени.
Данный метод позволяет не только изучать свойства опухолевых клеток в условиях in vitro (как до, так во время и после действия различных факторов на организм), а также исследовать механизмы опухолевой индукции с помощью различных канцерогенов.
Например, учеными многих стран в различных исследованиях используется линия раковых клеток эпителияшейки матки,названную HeLa,по имени американской темнокожей женщины Henrietta Lacks, умершей в 1951 году от данной опухоли.
Выведение раковых линий животных и линий животных, предрасположенных к развитию опухолевых заболеваний, осуществляется разными путями и методами.
Во-первых, этого можно достичь путём тщательного отбора особей со спонтанно возникающими опухолями, скрещиванием их между собой, а также скрещиванием особей их потомства. Существуют линии животных являющихся опухолевыми вследствие зараженности онкогенными вирусами (вирусом рака молочной железы, вирусом лейкоза мышей и т.д.). Хорошо известен так называемый фактор молока Биттнера (онковирус), названный так в честь автора блестящей работы (Bittner, 1936), доказавшего возможность передачи рака молочной железы от мышей высокораковой линии новорожденным мышатам низкораковой линии через материнское молоко.
Во-вторых, можно искусственно создать линии животных с генетическим дефектом, приводящим к возникновению опухолей. Это достигается с помощью введения в оплодотворенную яйцеклетку ДНК с заданными свойствами, предназначенную для интеграции с геномом этой клетки (например, с дефектом антионкогена). Вырастающая особь имеет в своем геноме уже созданные экспериментатором поломки, которые приводят к развитию опухолей. Другим способом такого воссоздания животных с опухолевой предрасположенностью является трансфекция раннего эмбриона (например, мыши) ретровирусом, несущим необходимый код, после чего во всех клетках хозяина (эмбриона) появляется новая генетическая информация, в последующем стимулирующая опухолевое перерождение клетки.
Во всех случаях животные со спонтанным развитием опухолей являются важнейшей моделью для изучения патогенеза и лечения онкологических заболеваний.
ПАТОГЕНЕЗ ОПУХОЛЕЙ
Канцерогенез – это сложный, длительный, многоэтапный и многостадийный процесс, основу которого составляет стойкая и необратимая патология генома клетки, приводящая к изменению программы жизнедеятельности, и, как правило, выбраковкой ее из популяции.
В настоящее время принято рассматривать опухолевый рост как двуэтапный и трехстадийный процесс.
Первый этап, именуемый как бластомоцитогенез претерпевает две стадии: 1) инициации (трансформации)и 2) промоции (активации пролиферации).
Второй этап, именуемый как бластомогенез, включает стадию прогресии.
Стадия инициации - повреждение генома клетки без изменения ее фенотипических свойств. Инициация вызывается генотоксическими химическими канцерогенами, вирусами и физическими факторами. Клетка может находиться в этом состоянии любое время: от нескольких дней до десятков и более лет.
Стадия промоции - изменение фенотипических свойств клетки. Эта стадия чаще всего вызывается химическими веществами - промоторами. В качестве промоторов могут быть любые вещества, в том числе эндогенные канцерогены, химические вещества, относящиеся к возможным канцерогенам, а также вещества, стимулирующие деление клеток. Время влияния промотора после действия инициатора не имеет большого значения. Описан случай развития рака мочевого пузыря через 48 лет после прекращения контакта с анилиновыми красителями. Химические вещества, обладающие промоторным действием на развитие опухолей у человека изучены недостаточно.
В эту стадию происходит более быстрое увеличение количества дочерних опухолевых клеток, образующих первичный опухолевый узел. Как только достигается критическое число (около 10 млрд) опухолевых клеток, их пролиферация становится прогрессирующей, неуправляемой, необратимой.
Стадия опухолевой прогрессии - рост одной или нескольких малигнизированных клеток до морфологически и клинически определяемой опухоли. Рост опухоли происходит медленно. Так, для роста от одной клетки до опухоли массой 1 грамм требуется деление 30-ти поколений клеток (минимальный срок такого роста - 90 дней). Для роста от 1 грамма до 1 килограмма - всего лишь 10 поколений и соответственно требуется как минимум 30 дней. Поскольку в опухоли пролиферирует лишь небольшой процент клеток, реальные сроки роста опухоли значительно дольше. Таким образом, наиболее медленный рост опухоли (до нескольких лет) может происходить на самых ранних стадиях, еще до клинических проявлений. В процессе роста происходит постепенное нарастание генетических повреждений клеток, что приводит к дальнейшему озлокачествлению опухоли. Это связано с тем, что по мере роста опухоли ее клетки оказываются в неравных условиях: на некоторые клетки продолжают действовать канцерогенные вещества, часть клеток подвергается воздействию со стороны иммунной системы, возникают разные условия для поступления к клеткам кислорода и питательных веществ. Это приводит к тому, что в опухоли появляются несколько клонов клеток, что повышает степень злокачественности опухоли. Постепенно наименее дифференцированный клон становится доминирующим.
Роль генов в канцерогенезе
В основе опухолевого роста всегда лежит повреждение генома клетки, вызываемое вирусами, физическими, химическими факторами или спонтанно. В настоящее время не подвергается сомнению генетическая теория канцерогенеза, согласно которой в основе малигнизации клетки лежит повреждение генома (клеточная мутация). Существуют и эпигеномные изменения клетки, способствующие развитию опухоли, что послужило основанием создания эпигеномной теории канцерогенеза.
Повреждение генома клетки происходит по трем классам регулирующих генов: 1) стимулирующих рост опухолевых клеток - протоонкогенов; 2) ингибирующих рост - антионкогенов; 3) отвечающих за апоптоз.
Клеточные протоонкогены. При изучении вирусного канцерогенеза было обнаружено, что онковирусы при попадании в клетки вносят в ее геном гены, стимулирующие и качественно нарушающие клеточную пролиферацию, а следовательно, способствующие малигнизации клеток. Эти гены были названы вирусными онкогенами. Цитогенетические исследования показали, что аналоги вирусных онкогенов имеются и в клетках человека и животных, где они выполняют различные функции регуляции синтетических процессов и деления. Более того, предполагается, что вирусы, несущие эти онкогены когда то “похитили” их из клеток хозяина. Поэтому, для более точного разделения, клеточные регулирующие гены - аналоги вирусных онкогенов были названы протоонкогенами, а в случае их чрезмерной экспрессии - клеточными онкогенами. Клеточные онкогены появляются при таких повреждениях генома клетки, когда происходит нарушение регуляции функции протоонкогенов, их нерегулируемая экспрессия и, соответственно синтез различных факторов (онкобелков), стимулирующих клеточную пролиферацию. Причины такой суперэкспрессии генов или чрезмерной активации их белков-продуктов могут быть различными.
Амплификация. Увеличение (обычно многократное) числа копий протоонкогенов, приводящее с активизации опухолевой трансформации клеток.
Транслокация. В результате перемещения протоонкогена, находящегося на одной хромосоме в область сильного промотора, расположенного на другой хромосоме, в результате чего неактивный протоонкоген может превращаться в онкоген.
Мутация. точечная мутация протоонкогена может приводить к изменению метаболизма и накоплению его белка-продукта.
Инсерция. Молчащий в обычных условиях протоонкоген клетки может активизироваться под влиянием внесённого в клеточный геном той или иной вирусной ДНК.
Трансдукция. Захват вирусами клеточных онкогенов и их разблокировка в геноме вирусов под влиянием разных промоторов, в итоге приводящие к расстройству генетической регуляции процессов деления клеток.
Деметилирование ДНК. Возникающий под влиянием, главным образом, химических канцерогенов и активных радикалов деметилированный участок ДНК становится активным и приводит к стимуляции деления клеток.
По механизму действия онкогены делятся на 4 основные группы:
1. Онкогены, кодирующие факторы роста.
2. Онкогены, кодирующие рецепторы к факторам роста - мембранным белкам с протеинкиназной активностью. Теория онкогенов предполагает выработку рецепторов с постоянной высокой активностью, т.е. не зависящей от стимуляции факторами роста.
3. Онкогены, кодирующие передачу сигнала в клеточной цитоплазме, например, связанные с системой G-протеина.
4. Онкогены, кодирующие ядерные белки, участвующие в транскрипции и репликации ДНК.
Антионкогены или гены супрессии опухолей. Их роль в канцерогенезе хорошо прослеживается при изучении наследственных опухолей. Известно, что многие наследственные опухоли связаны с мутациями некоторых генов, что приводит к потере их функции и возникновению опухолей. Такие гены были названы антионкогенами. Эта группа генов имеет различные функции в клетке. К антионкогенам, например, относятся следующие:
- Rb-1 - ген, кодирующий белок, обладающий ДНК- связывающими свойствами, регулирует транскрипцию ДНК; потеря этого антионкогена отмечается при наследственной ретинобластоме;
- NF-1 - ген, кодирующий ГТФ-азный активирующий протеин. Потеря функции этого гена приводит к снижению активности ГТФ-азы и увеличению содержания в клетке G-протеина; такой дефект встречается при некоторых опухолях нервной системы (нейрофиброматоз);
- APC - (adenopolyposis coli) ген, кодирующий белок, участвующий в поддержании межклеточных контактов, потеря этого гена наблюдается при опухолях толстой кишки, желудка, щитовидной железы;
- гены, регулирующие транскрипцию ДНК, контролирующие и отвечающие за репарацию ДНК, а также за многие другие функции в клетке.
При активации онкогенов и инактивации генов- супрессоров отмечается трансформация нормальной клетки и превращение ее в опухолевую.
Гены регулирующие апоптоз (програмированную смерть клеток). Поскольку одним из основных свойств опухоли является ее иммортализация, то изменение активности генов, влияющих на апоптоз имеет большое значение в этом процессе. Основными в этом семействе являются гены Р-53 (о котором говорилось выше), Вcl-2 и Вcl-x и некоторые другие гены. В зависимости от функции белков, кодируемых этими генами для развития опухоли необходимы различные нарушения. Если белки, например р53, запускают апоптоз, то для развития опухоли требуется выключение генов, которые эти белки кодируют. Если напротив, белки-продукты этих генов предотвращают апоптоз клеток, как например, Вcl-2 и Вcl-x, то при чрезмерной экспрессии таких генов в клетках происходит заметное удлинение их срока жизни, что способствует развитию опухоли.
Необходимо отметить, что в опухолевой клетке имеется не единичное, а множественное нарушение генома и, как правило, происходит активация нескольких онкогенов и выключение функции нескольких антионкогенов. Поэтапное повреждение генома клетки приводит к ее озлокачествлению, что называется опухолевой прогрессией. Таким образом, опухолевая прогрессия происходит при нарушении функции многих генов с различной локализацией в геноме. Последовательное повреждение различных генов генома может быть связано с длительным воздействием химических или других канцерогенных воздействий. При достижении опухолью определенных размеров и степени злокачественности она становится способной к метастазированию.