Методы выделения возбудителя заболевания и его растворимых антигенов
Бактериологический метод
Вся работа по выделению и дифференциации бруцелл из любого исследуемого материала проводится в строгом соответствии с санитарными правилами "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности СП 1.2.011-94". [25]
Посевы крови делают во время лихорадочного состояния больного, т.к. в этот период наблюдается наибольший процент выделения культур. Посевы крови проводят во флаконы (желательно прямоугольные) емкостью 100-200 мл, в которые наливают по 30-50 мл агара. Затем в каждый флакон стерильно добавляют по 25-30 мл бульона и выдерживают в термостате при 370С в течение 2-3 суток. Кровь в количестве не менее 10 мл засевают по 5 мл в два флакона. Один из флаконов инкубируют при повышенном содержании углекислоты (5-10%), а другой – в обычных условиях. Начиная с четвертого дня после посева, флаконы просматривают и при отсутствии роста культуры поверхность агара орошают бульоном. При положительном результате на поверхности агара появляются колонии бруцелл. Если в течение месяца бруцеллы не обнаруживаются, то в этом случае делают контрольный высев из бульона на твердую питательную среду.
Бруцеллы можно выделить также из костного мозга, мочи, спинномозговой жидкости, экссудата из бурситов, грудного молока, желчи, мокроты, трупного материала и т.д.
Для определения принадлежности выделенных культур к роду Brucella используют следующие методы: изучение морфологии колоний, микроскопия окрашенных препаратов по Граму или Козловскому, люминесцентная микроскопия и проба со специфической сывороткой в реакции агглютинации на стекле.
Колонии бруцелл на агаре бесцветны, выпуклы (холмиком), с гладкой поверхностью, гомогенны,иногда с нежной зернистостью в центре колонии. С возрастом нежные и прозрачные колонии постепенно мутнеют. Величина колоний может быть различной. Наряду с крупными, достигающими в диаметре 3-4 мм и больше, могут быть очень мелкие – точечные колонии 0,1-0,05 мм. Различные факторы (pH питательной среды, влажность, наличие бактериофага в культуре и др.), влияющие на биологию культуры, могут привести также к изменению внешнего вида колоний (встречаются зернистые, стекловидные колонии, растущие в толще агара, эрозированные, сухие, слизистые, радиально исчерченные и др.)[1].
При окраске по Граму бруцеллы грамотрицательны. Окрашивание препаратов по способу Козловского: фиксированные препараты, окрашивают 0,5% водным раствором сафранина при подогревании, промывают дистиллированной водой и докрашивают 0,5%-ным водным раствором малахитовой или бриллиантовой зелени в течение 40-50 с. Бруцеллы сохраняют красную окраску сафранина, а остальные бактерии окрашиваются в зеленый цвет[2].
Для предварительной, быстрой идентификации ставят реакцию агглютинации на стекле. На предметное стекло наносят каплю специфической сыворотки, разведенной 1:25 0,5% карболизированным физиологическим раствором, в которой эмульгируется одна петляисследуемой культуры. В положительных случаях быстро (в течение 1 минуты) наступает агглютинация с образованием хлопьев, в отрицательных –суспензия остается гомогенной. Для контроля исследуемую культуру эмульгируют в капле нормальной сыворотки или физиологическом растворе (Приложение 6).
Биологический метод
Для выделения бруцелл из материалов, загрязненных посторонней микрофлорой и при малой концентрации бруцелл в исследуемом материале, используют морских свинок (весом 300-350 г) или белые мыши (весом 17-18 г). Исследуемый материал вводят подкожно в паховую область в дозах не более 0,5 мл для мышей и 1 мл для морских свинок.
Вскрытие белых мышей производится через 20-25 дней, а морских свинок – через 30-35 дней после введения исследуемого материала. Перед вскрытием у свинок следует взять кровь из сердца для исследования сыворотки в реакции агглютинации. Для посевов у морских свинок берут целиком лимфатические узлы (регионарные к месту введения исследуемого материала): паховый, подчелюстной, шейный, парааортальный, кусочки селезенки, печени, костный мозг, кровь, мочу; у белых мышей лимфатические узлы: паховый, акселярный, парааортальный, подчелюстной, кусочки селезенки и печени. Лимфатические узлы, кусочки печени и селезенки помещают в стерильную чашку. Костный мозг для засева берут пипеткой из рассеченной бедренной кости. Посевы крови из сердца, а также мочи и костного мозга производят стерильной пипеткой непосредственно на питательные среды (агар и бульон). Лимфатические узлы животных перед посевом рекомендуется надсекать ножницами. После этого каждый лимфатический узел и кусочки органов берут "уколом" стерильной деревянной палочки и вносят первоначально в пробирку с агаром, где той же палочкой материал раздавливают и тщательно втирают в поверхность питательной среды. Затем остатки посевного материала переносят в пробирку с бульоном.
Посевы выдерживают при 370С в термостате 20-25 дней. Просмотр посевов на пробирках с агаром и бульоном производят каждые 3-4 дня, из помутневших бульонов делают высевы на пробирки со скошенным агаром.
Результат исследования оценивается положительно при выделении хотя бы одной колонии бруцелл из организма животного или при наличии положительной реакции Райта у животных в титре не менее 1:20 (Приложение 6). [11]