Ii. методы обнаружения и исследования простейших.

Кишечные простейшие представлены амебами и жгутиковыми. Выделяют две диагностические стадии: вегетативная стадия или трофозоит и покоящаяся стадия или циста. Как первая, так и вторая стадии могут выделяться с фекалиями. Трофозоиты обычно обнаруживаются в жидких или полужидких фекалиях; цисты обычно встречаются в оформленном стуле. Однако как одна, так и другая стадии могут обнаруживаться в одной и той же пробе фекалий.

Трофозоиты и цисты можно наблюдать и в нативных препаратах фекалий с физиологическим раствором. В ряде случаев видовая идентификация может потребовать исследования окрашенных препаратов.

1. ИССЛЕДОВАНИЕ ИСПРАЖНЕНИЙ.

Испражнения (кал) исследуют с целью обнаружения простейших кишечника. Все больные острыми и хроническими кишечными заболеваниями, в первую очередь при наличии крови и слизи в стуле, должны подвергаться лабораторному обследованию на зараженность простейшими.

Движение простейших – один из самых характерных признаков, который позволяет поставить правильных диагноз. Поэтому основное правило – исследование только свежего материала, не позже, чем через 20-30 мин после его выделения. При невозможности немедленного исследования испражнения помещают в консервант (не заменяет нативных мазков). Исследование на цисты простейших допускается в течение суток.

В первую очередь выбирают и исследуют неоформленные фекалии с патологическими примесями, так как в них можно обнаружить подвижные формы патогенных простейших.

В плотном оформленном стуле содержатся только цисты. Они более устойчивы, чем вегетативные формы, поэтому оформленный кал можно исследовать и через более поздние сроки, но, как правило, в день взятия.

А). Исследование мазков фекалий. Обязательным является исследование нативного мазка и мазка, окрашенного раствором Люголя.

Нативный мазок. Препарат готовится на предметном стекле без добавления изотонического раствора хлорида натрия. В нативном мазке обнаруживают подвижные формы простейших, по особенностям движения можно диагностировать отдельные виды.

Окраска раствором Люголя. Цисты отличаются постоянной формой и наличием оболочек. Строение цист видно плохо, не просматриваются ядра. Поэтому исследуют и мазок, окрашенный раствором Люголя. Цисты окрашиваются в золотичто-коричневый цвет. На фоне цитоплазма заметны ядра, видны их строение и число. Хорошо виден гликоген, окрашивающийся в разные оттенки коричневого цвета. При окраске раствором Люголя вегетативные формы погибают и определяются с трудом.

Б). Методы обогащения или накопления цист. Применяются только с целью обнаружения цист. Для исследования жидких фекалий, в которых, как правило, обнаруживаются вегетативные формы простейших, эти методы не пригодны.

Метод всплывания. При смешивании материала, содержащего цисты, с жидкостями, имеющими бóльшую относительную плотность, чем цисты, последние всплывают и находятся в поверхностной пленке. Предварительно отмывают цисты от фекалий, затем цетрифугируют. После этого к осадку добавляют 33% раствор сульфата цинка. Центрифугируют, исследуют поверхностную пленку, которую снимают петлей.

Метод формалин-эфирного обогащения. При обработке фекалий по этому методу происходит отделение и концентрация цист простейших кишечника.

2. ИССЛЕДОВАНИЕ КРОВИ.

С целью обнаружения гемопаразитов микроскопируют с иммерсионным маслом под большим увеличением мазок и толстую каплю крови.

Толстую каплю с отличие от мазка не фиксируют. Под влиянием водных красителей нефиксированные эритроциты гемолизируются, препарат становится прозрачным. Это ускоряет и облегчает обнаружение паразитов, так как в одном поле зрения можно исследовать гораздо больший объем крови, чем в мазке.

Окраску проводят по Романовскому-Гимзе. Раствор красителя должен быть слабо щелочной (рН 7,1-7,2). Для этой цели краску разводят физиологическим раствором. Правильно окрашенная толстая капля имеет фиолетовый цвет.

3. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЫДЕЛЕНИЙ МОЧЕПОЛОВЫХ ПУТЕЙ.

Выделения мочеполовых путей исследуют для обнаружения мочеполовых трихомонад. Трихомонады легко отличить от лейкоцитов и других клеток по характерному движению, наличию жгутиков и ундулирующей мембраны. Более четко они видны при использовании темнопольной или фазово-контрастной микроскопии.

Просмотр нативных и окрашенных препаратов способствует эффективности лабораторного исследования.

4. ИССЛЕДОВАНИЕ ДРУГИХ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ.

А). Желчь и содержимое 12-перстной кишки, полученные при дуоденальном зондировании, осматривают и микроскопируют комочки слизи. Кроме того, материал центрифугируют, просматривают под микроскопом осадок. С помощью этого метода можно обнаружить вегетативные стадии лямблий.

Б). Спинномозговую жидкость, полученную при пункции, центрифугируют и исследуют осадок. Из осадка готовят нативные мазки, окрашивают их по Романовскому и микроскопируют. В препаратах можно обнаружить патогенных амеб, токсоплазм, трипаносом.

В). В гное, извлеченном при пункции абсцессов внутренних органов, микроскопически можно обранужить амеб. Из язв толстого кишечника получают отделяемое и немедленно микроскопируют – при этом можно выявить подвижные вегетативные стадии (эритрофаги) дизентерийной амебы.

Г). Мокроту исследуют в нативном мазке, а также окрашивают раствором Люголя. В мокроте можно обнаружить пневмоцисты, изредка ротовые амебу и трихомонаду.

Д). Костный мозг исследуют с целью обнаружения лейшманий и некоторых других простейших. Получают костный мозг при пункции грудины, гребня подвздошной или головки большеберцовой костей, готовят мазки на предметных стеклах и микроскопируют после окраски по-Романовскому.

Е). При кожных поражениях исследуют мазки в случае подозрения на кожный лейшманиоз. Исследуют кожу из области вокруг язвы и в зоне инфильтрата по краю язвы. Лейшмании обнаруживают в макрофагах, а также вне клеток в виде овальных или удлиненных телец размером 3-5 мкм.

Не рекомендуется брать материал непосредственно из язв, так как наличие микрофлоры и остатков разрушенных клеток затрудняют поиски лейшманий.

Ж). Лимфатические узлы пунктируют, полученный материал исследуют для приготовления окрашенных мазков, посева на питательные среды и биологической пробы с целью обнаружения лейшманий, трипаносом, токсоплазм.

З). В некоторых случаях приходится исследовать кусочки органов или тканей, полученных во время операции (биопсия) или вскрытия (аутопсия). В частности, это необходимо для обнаружения токсоплазм и их цист в гистологических срезах из головного мозга, печени, селезенки, а также пневмоцист в препаратах из легких.

5. СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ.

Протозойные болезни сопровождаются выработкой иммунитета и появлением в сыворотке крови антител, на обнаружении которых основаны серологические методы исследований.

С указанной целью применяют

· реакцию связывания комплемента – РСК (токсоплазмоз),

· реакцию гемагглютинации – РГА (трихомоноз, токсоплазмоз),

· реакцию иммунофлюоресценции – РИФ (малярия, лейшманиоз, пневмоцистоз, амебиаз, токсоплазмоз),

· реакцию антител, меченных ферментами – РЭМА (лейшманиоз, токсоплазмоз, амебиаз, малярия) и др.

Например, на мазки-отпечатки с паразитом наносят капли исследуемой сыворотки в различных разведениях и затем – люминесцирующую сыворотку. Если в исследуемой сыворотке имелись антитела, то вокруг клеток паразита в мазке образуются светящиеся ореолы, наблюдаемые при микроскопии препаратов в люминесцентном микроскопе.