Газожидкостная хроматография.

Метод основан на распространении анализируемых веществ между неподвижными жидкими фазами и инертным газом. Перенос вещества происходит из-за различной растворимости компонентов смеси в жидкой фазе, нанесенного на поверхность инертного носителя.

Разделяют с помощью ГЖХ: вещества, испаряющиеся без разложения или вещества, которые разлагаются, но дают идентифицируемые газообразные продукты; жидкости.

Схема:

1 – Газовый баллон с газом-носителем.

2 – Термостат.

3 – Колонка

4 – Дозирующее устройство.

5 – Детектор

6 – Усилитель тока.

7 – Регистрирующее устройство.

Основная часть хроматографа – колонка. Сделана из стекла или металла, размер от нескольких см до нескольких метров. В колонке находится неподвижная жидкая фаза, нанесенная на пористый материал – носитель.

Носитель – инертное вещество, которое при развитой поверхности имеет малую адсорбционную активность. Получают из огнеупорного кирпича и диатомитовых земель (содержат до 90% SiO2). Носитель просеивают и прокаливают.

Неподвижная жидкая фаза – органические вещества, которые отличаются по полярности (парафин, силиконовые масла, глицерин). При нормальной температуре – твердые вещества или вязкие жидкости с температурой кипения более 300°С. Неподвижная жидкая фаза наносится на носитель следующим образом: ее растворяют в толуоле, добавляют носитель, перемешивают, растворитель упаривают, перемешивают. Образуется насадка. Эту насадку набивают в колонку, колонку термостатируют не выше 350°С (чтобы не смыть неподвижную жидкую фазу).

Детектор:

а) Катарометр (по теплопроводности) – используют для анализа органических и неорганических соединений (HSN, CO).

Недостатки: низкая чувствительность, следовательно, плохое разделение. Обладает чувствительностью к воде, следовательно, нельзя брать дистиллят.

Состоит из 2-х ячеек:

Первая ячейка – сравнения, вторая – аналитическая.

Внутри каждой ячейки спираль из Wo, Ni, Pt. При запуске хроматографа чрез катарометр проходит газ-носитель (гелий, N2), т.к. через обе ячейки идет только газ-носитель, перо самописца пишет прямую линию. При введении анализируемой пробы в аналитическую ячейку поступает смесь газа-носителя с анализируемым веществом, происходит изменение теплопроводности, изменяется сопротивление, перо самописца отклоняется от нулевой линии. При использовании катарометра на хроматограмме первый пик – пик воздуха (прямоугольный), который вносится вместе с анализируемой пробой.

б) Детектор ионизационно-пламенный (ДИП). Более чувствителен, чем катаромтер, универсален, мало чувствителен к воде (можно анализировать дистиллят). Используют газы-носители: He или N2, воздух, водород. Последние два необходимы для создания пламени, в котором сгорает или облучается проба. Образуются ионы, возникает ионный ток, появляется пик на хроматограмме. Пика воздуха не будет.

Способы идентификации вещества на хроматограмме:

Газовая или жидкостная проба вводится в инжектор и газом-носителем продавливается по колонке. В колонке вещество сорбируется на неподвижной жидкой фазе. Вещества, которые плохо сорбируются, быстро выходят из колонки и наоборот. Разделенное вещество, попадая в детектор, образуют ток, он усиливается усилителем и самописец фиксирует изменения.

Хроматограмма – график величины сигнала во времени.

Идентификация по расстоянию (времени) удерживания.

Абсолютное расстояние удерживания – расстояние от момента ввода пробы до момента выхода пробы. Абсолютное расстояние (время) удерживания требует четкой фиксации параметров (температуры термостата, скорости газа-носителя, объема пробы, соотношения компонентов в пробе), поэтому удобнее использовать относительное расстояние (время) удерживания. Для этого в пробу вводят стандартное вещество с известным абсолютным расстоянием удерживания и находят соотношение:

Для определения, каким летучим ядом произошло отравление, следует использовать колонки разной полярности (может быть отравление несколькими веществами).

Количественное определение:

1. Метод абсолютной калибровки. Делается серия растворов с известной концентрацией для построения калибровочного графика. Проводят ГЖХ газовой фазы каждого раствора и строят калибровочный график по высоте или площади пика. Концентрацию анализируемого вещества находят по калибровочному графику.

2. Для ускорения используют метод внутреннего стандарта. Берут 5 проб с известной концентрацией, в каждую пробу вводят одинаковое количество стандарта. Получают газовую фазу, вводят в хроматограф, получают хроматограмму и находят отношения высот или площадей пиков анализируемого вещества и стандарта, строят калибровочный график «отношение от концентрации». Далее в анализируемую пробу вводят то же количество стандарта, что и для построения калибровочного графика и определяют концентрацию по калибровочному графику.

ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ ИСПЫТАНИЯ

Предварительные испытания проводят перед составлением плана хим-токс анализа. Результаты позволяют исключить ряд веществ и предположить какие вещества или группы веществ могут содержаться в объекте. Позволяют рационально расходовать биоматериал и экономические резервы и время анализа.

Определение рН среды

Для исследования используют б/ж или водную вытяжку из б/м. Для получения водн вытяжки небольшое кол-во б/измельчают, встряхивают с небольшим колич-вом воды. Надосадочную жидкость сливают и исследуют.

Универсальные индикаторн бумажки:

- Красная лакмусовая бумажка (КЛБ)

- Синяя лакмусовая бумажка (СЛБ)

1) Если при исследовании б/ж СЛБ покраснела, то реакция среды кислая. Затем проводят исследования с красной бумажкой Конго. Если б.Конго синеет, о значит в объекте орг или минеральные кислоты введенные извне. Для определения хар-ра кислоты б/ж разбавляют в 5 раз и вновь наносят на б.Конго. При отравлении мин кислотой б.Конго Синеет, если орг к-та – цвет не изменяется.

2) Если при нанесении б/ж на КЛБ она синеет, то среда щелочная. Она м.б. обусловлена наличием едкой щелочи, карбонатной щелочи, аммиака.

- отличие едкой и карбонатной щелочи:

к 1мл б/ж + 1-2к р-ра ф/ф à роз окраш-е + по каплям BaCl2. При наличии едкой щелочи розовая окраска сохраняется: 2NaOH + BaCl2 à Ba(OH)2 + 2 NaCl

При наличии карбонатной щелочи окраска ф/ф исчезает и появляется осадок:

Na2CO3 + BaCl2 à 2NaCl + BaCO3↓

- определение аммиака:

часть б/ж после обработки BaCl2 наносят на КЛБ, бумажка синеет. Оставляют на воздухе на 20 минут. Если при этом бумажка приобрела розовое окрашивание – аммиак.
ЛЕТУЧИЕ ЯДЫ

1. Синильная кислота и ее соли. 2. Хлорированные углеводороды (CHCl3, CCl4, дихлорэтан). 3. Фенолы и крезолы. 4. Спирты: С1-С5.

5. Альдегиды и кетоны. 6. Карбоновые кислоты алифатического ряда.

7. Нитро и аминопроизводные алифатического ряда. 8. Гликоли (этиленгликоль).

Основной метод изолирования: метод дистилляции.

Для веществ, не смешивающихся с водой, для веществ, образующих азеотропную смесь, для веществ, смешивающихся с водой, для твердых веществ (хлорофос).

Температура кипения определяемого вещества всегда ниже, т.к. общее давление равняется сумме парциального давления определяемого вещества и воды.

Плюсы: Можно изолировать вещества органической и неорганической природы, одновременно с изолированием идет очистка органического вещества, можно использовать действующие вещества с высокой температурой плавления или те, которые при температуре разлагаются.

Минусы: Длительность, большой объем дистиллята, необходима аппаратура.

Способы дистилляции:

1) Макродистилляция. На анализ достаточно более 50,0 биологического объекта.

2) Макродистилляция с селективным уносчиком для получения азеотропной смеси. Для HCN используется N2, для этиленгликоля – бензол.

3) Микродистилляция. Если у нас имеется небольшое количество биологического объекта. Перегонка осуществляется с использованием дефлегматора (нет паровика).

4) Метод фракционной перегонки – происходит разделение яда по фракциям, которые анализируются отдельно.

5) метод паро-воздушной дистилляции. Для спиртов (метод Карандаева), для HCN (метод Герасимова).

К биологической жидкости добавляют K2CO3 чтобы из нее произошло высаливание спиртов. Бюкс помещают в термостат с 50-60°С. Спирт возгоняется, взаимодействует с реактивами – если есть зеленое окрашивание, значит, было отравление спиртом.

6) Суховоздушная дистилляция. Используют ГЖХ. Метод надежен, универсален, быстр. В пенициллиновый флакон помещают 1-2 мл биожидкости, закрывают пробкой, плотно укупоривая (алюминиевый колпачок), помещают в термостат. Шприцом отбирают газовую фазу и вводят в инжектор хроматографа.

7) Прямой ввод объекта в хроматограф с использованием предколонки, чтобы избавить от белков.

Условия дистилляции.

Четкий контроль рН среды. Чтобы провести дистилляцию, биоматериал подкисляют щавелевой или винно-каменной кислотой до рН=2.

Нельзя подкислять минеральными кислотами, т.к. можно потерять или переоткрыть яд.

HCN HCOONH4

Ph-OSO3H Ph-OH + H2SO4

Не подкисляем, когда определяем свободную уксусную кислоту (промывные воды желудка).

Подкисляем H2SO4 и H3PO4 при определении общей уксусной кислоты (свободной и связанной с белками).

Подщелачиваем для веществ основного характера (никотин, анабазин, пахикарпин).

Подкислять необходимо, чтобы разрушить связь ТВ с белками.