На показатель преломления и процент белка по Рейссу
| № п/п | Показатель преломле-ния | Сыворотка крови | № п/п | Показатель преломления | Сыворотка крови | ||
| Отсчет по шкале | Белок в % | Отсчет по шкале | Белок в % | ||||
| 1,33705 | 0,63 | 1,34612 | 5,90 | ||||
| 1,33743 | 0,86 | 1,34650 | 6,12 | ||||
| 1,33781 | 1,08 | 1,34687 | 6,34 | ||||
| 1,33820 | 1,30 | 1,34724 | 6,55 | ||||
| 1,33858 | 1,52 | 1,34761 | 6,77 | ||||
| 1,33906 | 1,74 | 1,34798 | 6,98 | ||||
| 1,33934 | 1,96 | 1,34836 | 7,20 | ||||
| 1,33972 | 2,18 | 1,34873 | 7,42 | ||||
| 1,34000 | 2,40 | 1,34910 | 7,63 | ||||
| 1,34,048 | 2,62 | 1,34947 | 7,85 | ||||
| 1,34086 | 2,84 | 1,34948 | 8,06 | ||||
| 1,34124 | 3,06 | 1,35021 | 8,28 | ||||
| 1,34162 | 3,28 | 1,35058 | 8,49 | ||||
| 1,34199 | 3,50 | 1,35095 | 8,71 | ||||
| 1,34237 | 3,72 | 1,35132 | 8,92 | ||||
| 1,34275 | 3,94 | 1,35169 | 9,14 | ||||
| 1,34313 | 4,16 | 1,35205 | 9,35 | ||||
| 1,34350 | 4,38 | 1,35242 | 9,57 | ||||
| 1,34388 | 4,60 | 1,35279 | 9,78 | ||||
| 1, 34420 | 4,81 | 1,35316 | 9,99 | ||||
| 1,34463 | 5,03 | 1,35352 | 10,20 | ||||
| 1,34500 | 5,25 | 1,35388 | 10,41 | ||||
| 1,34537 | 5,47 | 1,35425 | 10,62 | ||||
| 1,34575 | 5,68 | 1,35461 | 10,76 |
Определение чистоты гамма-глобулиновой фракции. Проводят электрофоретически. Для этой цели применяют боратный буфер (на 5 л буфера берут: борной кислоты – 43,414 г; NаОН – 14,0 г; концентрированную НСl –12,7 мл) и краситель, содержащий в 1 л 5 % уксусной кислоты, 2 г хлористого аммония, 10 г каломеля и 1 г бромфенол синего. Смесь оставляют на ночь при помешивании и фильтруют. Режим разгонки - 16-18 часов при силе тока 0,5 ма на 1см ширины бумажной ленты.
Определение стерильности препарата. Проводят путём высевов гамма-глобулина на питательные среды МПБ и МПА. Посевы выдерживают при 370 С в течение 8 суток.
Определение безвредности препарата. Контроль на безвредность проводится с использованием лабораторных животных - морских свинок и белых мышей.
Морским свинкам весом 250-350 г вводят подкожно 3 мл, а белым мышам весом 15-20 г - 0,5 мл гамма-глобулина. За животными наблюдают 5-7 дней. За это время у морских свинок не должно быть воспалительных реакций на месте введения препарата, мыши должны оставаться здоровыми.
Контроль на специфичность. Проводят в случаях получения специфического иммунного гамма-глобулина. Проводится так же, как и контроль соответствующей иммунной сыворотки. Дозы гамма-глобулина берут в 5-10 раз меньше доз исходной сыворотки.
Для определения специфичности гамма-глобулина проводят реакцию агглютинации на стекле, используя в качестве антигена микроорганизм, антитела против которого должны находиться в препарате. При положительной реакции образуются хлопья, следовательно гамма-глобулин обладает специфичностью.
Также вводят белым мышам подкожно 0,01 мл гамма-глобулина и 500 млн микробных клеток возбудителя. Если изменений в общем состоянии животных не наблюдается, препарат является специфичным.
Хранение гамма-глобулина и срок годности.
Гамма-глобулин должен храниться при температуре 40-100 С. Срок годности гамма-глобулина - 1,5-2 года с момента изготовления препарата.
Получение гамма-глобулина на биопредприятиях
Как упоминалось выше, иммуноглобулины выделяют из гипериммунных сывороток.
Сыворотку получают методом цитрирования крови с последующим сепарированием и дефибринированием плазмы. Гипериммунные сыворотки, получаемые из крови путём удаления форменных элементов и фибрина, называются нативными в отличие от сывороток, подвергнутых дополнительной очистки и концентрации специальными методами.
Но прежде чем приготовить сывороточные и глобулиновые препараты, необходимы ещё два этапа - отбор животных-продуцентов и гипериммунизация животных.
Принципы очистки сывороток основаны на выделении из них активных белковых фракций, преимущественно гамма-глобулинов, и удалении балластных фракций, не являющихся носителями антител.
Выделенные фракции растворяют в меньшем объёме растворителя, по сравнению с исходным объёмом, что позволяет препарат сконцентрировать и вводить животному в меньших дозах.
В производственных условиях очистку и концентрацию сывороток проводят чаще всего комбинированным способом, включающим следующие стадии:
- ферментативный гидролиз;
- прогрев ферментативных сывороток в кислой среде;
- солевое фракционирование;
- дополнительная очистка от неактивных белков;
- использование органических растворителей, сорбентов;
- дополнительное выдерживание сывороток при пониженных температурах.
При такой обработке удаляется до 80-85 % балластных белков сыворотки (Тутов И. К. 1997 г).
Кроме указанных методов очистки и концентрации сывороточных препаратов, гамма-глобулиновая фракция выделяется из сыворотки крови методом ультрафильтрации. Производственные опыты по ультрафильтрации сывороток дали возможность сконцентрировать их в три раза и практически без потерь иммуноглобулинового компонента.
Получение гамма-глобулина риваноловым методом
В условиях хозяйства
В условиях хозяйства можно легко и просто получить гамма-глобулин риваноловым методом и использовать его для профилактики болезней молодняка и лечения больных животных.
Например. Берут кровь от клинически здоровых коров хорошей упитанности (вакцинированных против различных инфекционных болезней; животных-реконвалесцентов, не являющихся микробоносителями; за 2 месяца до отела или через 2 недели после отела).
От одной коровы можно брать до 3 литров крови из яремной вены.
Кровь отстаивают при комнатной температуре до полного свертывания и отделяют сыворотку. К 100 мл сыворотки крови добавляют 30 мл 3 %-ного раствора риванола (этакридин лактат). Сыворотка мутнеет, в результате выпадения в осадок альбуминов, альфа- и бета-глобулинов, которые связываются с риванолом. Смесь сыворотки и риванола отстаивают в течение 30 минут в условиях холодильника (4° С). Затем в полученный раствор добавляют поваренную соль (NaCl) из расчета 0,5-0,8 % к объему раствора (0,65-1,04 г на 130 мл объема сыворотки с риванолом) для дополнительного осаждения балластных белков и уплотнения осадка. Смесь сыворотки, риванола и соли отстаивают в течение 1 часа при комнатной температуре и фильтруют через бумажные обеззоленные фильтры. На фильтре остаются альбумины, альфа- и бета-глобулины, а также риванол, в фильтрате - гамма-глобулин.
Раствор гамма-глобулина должен быть прозрачным, желтоватого или розоватого цвета. Препарат фасуют в стерильные стеклянные флаконы и закрывают резиновыми пробками. Флаконы и пробки стерилизуют кипячением в течение 1 часа.
Затем проводят контроль качества готового препарата.
В условиях хозяйства можно провести контроль на стерильность и безвредность полученного гамма-глобулина.
Для определения стерильности укупоренный флакон гамма-глобулина помещают в теплое место (возле батареи или калорифера) на 3 суток. Стерильный раствор гамма-глобулина через 3 суток останется прозрачным. Если раствор помутнел, значит в нем размножаются микроорганизмы. Всю полученную партию гамма-глобулина бракуют.
Для определения безвредности полученного гамма-глобулина, его вводят здоровому теленку в дозе 1,0 мл на 1 кг живой массы подкожно или внутримышечно. Если препарат безвреден, то изменений в общем состоянии животного не наблюдается.
Полученный гамма-глобулин применяют подкожно, для профилактики желудочно-кишечных и респираторных болезней молодняка животных в дозе 0,5 мл на 1 кг живой массы 1 раз в день 2 дня подряд, с терапевтической целью – в дозе 1,0 мл на 1 кг живой массы 1 раз в день 3 дня подряд. Первую инъекцию гамма-глобулина животному вводят дробно: вначале 1:10 дозы, через 15 минут (если не отмечаются отклонения в общем состоянии животного) вводят оставшееся количество препарата. Гамма-глобулин, полученный риваноловым методом, можно также давать животным внутрь.
Гамма-глобулин должен храниться при t = 40 С, в темном месте. Срок годности 0,5-1,0 год с момента изготовления препарата.