Заслуженный деятель науки РФ И.П, Татарченко

Заслуженный деятель науки РФ И.П, Татарченко

РЕФЕРАТ

«Гипергомоцистеинемия и эндотелиальная дисфункция

В практике врача»

Выполнила: ординатор первого года

По специальности «Кардиология»

Абраменкова Е.М.

ПЕНЗА 2013

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВЭЖХ -Высокоэффективная жидкостная хроматография

ГНИЦ – Государственный научно - исследовательский центр ГЦ – ГомоцистеинЖКТ -желудочно – кишечного тракта ЖХВД - Жидкостная хроматография высокого давленияИБС – Ишемическая болезнь сердцаMTHFR - метилентетрагидрофолат- редуктаза МХ – митохондрии ОКС коронарного синдрома ПОЛ - Перикисное окисления липидов РФ -Российская Федерация УФ –ультрафиолетовой детекцией. ФН4 – тетрагидрофосфат; ЭДТА - Этилендиаминтетрауксусная кислота

ПЛАН

1. Введение……………………………………………………………………………….
2. История вопроса………………………………………………………………………
3. Гомоцистеин, роль в организме...................................................................................
4. Метаболизм гомоцистеина……………………………………………………………
5. Методы определения гомоцистеина в плазме. Новые подходы …………………..
6. Гомоцистеин в акушерстве…………………………………………………………….
7. Гомоцистеин в травматологии………………………………………………………..
8. Эндотелиоз – главный враг кардиологии……………..……………………………..
9. Эндотелиальная дисфункция………………..………………………………………...
10. Методы определения эндотелиальной дисфункции………………………………….

\

Введение.

Сердечно- сосудистые заболевания в XXI веке остаются ведущей причиной инвалидизации и смертности населения большинства индустриальных стран мира.( 8,13,109,115,188,190) В структуре общей смертности в Российской Федерации (РФ) на долю болезней системы кровообращения приходится 56% и около половины из них - 46,9% - на долю ИБС. По данным Фрамингемского исследования у 40,7% мужчин и у 56,5% женщин ИБС дебютирует в форме стабильной стенокардии. В среднем число больных, страдающих стенокардией, составляет около 30-40 тысяч на 1 миллион населения. (11,163,169, 228)

Следует отметить значительное «омоложение» этой патологии, раннюю инвалидизацию и смертность в трудоспособном возрасте, ограничение профессиональной деятельности и активного долголетия. По данным ГНИЦ профилактической медицины, в Российской Федерации почти 10 млн. трудоспособного населения страдают ИБС и более трети из них имеют стабильную стенокардию, что значительно ухудшает качество жизни больных и в 2 раза увеличивает риск смерти от острых коронарных синдромов. Наиболее частой причиной ИБС является атеросклеротический процесс, который наблюдается в 95-97% случаев.

До недавнего времени о ГЦ практически не говорили, однако сегодня трудно найти медицинское издание, которое не обсуждало важную роль нарушений его метаболизма в развитии сердечно– сосудистых и ряда других заболеваний. Такие классические факторы риска, как гипертония, нарушения жирового обмена и курение, объясняют лишь 30—50% всех сердечно- сосудистых заболеваний. Другим важным фактором риска является, очевидно, уровень гомоцистеина, который в многочисленных исследованиях убедительно коррелирует с наличием сердечно- сосудистых заболеваний. (8,10,26,135,162,169,170,203,292,340)

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.

8. Аронов Д.М. Кардиологическая реабилитация в России — проблемы и перспективы / Д.М. Аронов, Р.Г. Оганов // Российский кардиологический журнал. — 2001.-Т. 32, № 3. -С.4-9.

10. Бабушкина Г.В., Картелищев А.В. Клинические маркеры эффективности низкоэнергетического лазерного излучения больных с ишемической болезнью сердца // Лазерная медицина. 1998. — Т.2, вып.2-3. -С.20-24.

11. Баранова Е.И., Большакова О.О. Клиническое значение гомоцистеинемии (обзор литературы) // Артериальная гипертензия. 2004. -Т.10,№ 1. - С.12-18.

13. Баркаган З.С., Костюченко Г.И. Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза. — М., 2002. 296 с.

ишемической болезни сердца: Автореферат дис. . д-ра мед. наук. Москва, 2007. -49 с. 26. Бриль Г.Е. Клеточные механизмы биологического действия низкоэнергетического лазерного излучения // Новые направления лазерной медицины: Материалы Международной конференции. Москва, 1996. - С.283-284.

109. Лобанов А.Н. Молекулярно — генетический механизм эффекта лазерной биостимуляции / А.Н. Лобанов, А.Н. Малов, С.Н. Малов, И.А. Сергеева //

115. Мазур Н.А. Дисфункция эндотелия, монооксид азота и ишемическая болезнь сердца//Терапевтический архив. 2003. - Т. 75, № 3.-С.84-86.

135. Насонов E.JL, Баранов А.А., Шилкина Н.П. Маркеры активации эндотелия (тромбомодулин, антиген фактора Виллебранда и ангиотензинпревращающий фермент): клиническое значение // Клиническая медицина. 1998. -№11.- С.4-9.

162. Самойлов Н.Г. Морфологические основы лазерной терапии // В кн.: Низкоинтенсивная лазерная терапия. Под ред. С.В. Москвина, В.А. Буйлина — М.: ТОО «Фирма «Техника», 2000. С.95-115.

163. Сафронов И.Д., Рагино Ю.И., Куликов В.Ю. Роль жирорастворимых антиоксидантов в патогенезе атеросклероза / Бюллетень СО РАМН. 2006. -№2(120).-С.43-46.

169. Соболева Г.Н. Функциональное состояние эндотелия коронарных и периферических артерий у больных ишемической болезнью сердца и гипертонической болезнь, медикаментозная коррекция выявленных нарушений: Автореферат дис. д-ра мед. наук. — Москва, 2008. 25с.

170. Соболева Е.В. Гомоцистеинемия и ремоделирование артерий у больных хроническими формами ишемической болезни сердца: Автореферат дис. . канд. мед. наук. Самара, 2007. - 25с.

188. Чичук Т.В., Страшкевич И.А., Клебанов Г.И. Свободнорадикальные механизмы стимулирующего действия низкоинтенсивного лазерного излучения // Вестник РАМН. 1999. - №2. - С.27-32.

189. Шевченко О.П., Олефиренко Г.А., Червякова Н.В. Гомоцистеин — Патохимия крови для врачей. Москва, 2002. -48с.

190. Шевченко О.П., Олефриенко Г.А. Гипергомоцистеинемия и ее клиническое значение // Лаборатория. — 2002. № 1. — С.3-7.

203. Baxter D.G. Therapeutic Lasers. Theory and Practice. Churehill Livingstone, 1994.-259 p. 228. Furchgott R.F., Zawadzki J.V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine // Nature. — 1980. — P. 373-376. 257. Gellekink H. Genetic determinants of plasma total homocysteine 292. Tawakol A, Omland T, Gerhard M et al. Hyperhomocysteinemia is associated with impaired endothelium-dependant vasodilatation in humans // Curculation. — 1997. — 95. — P. 1119-1121. 306. Welch G., Loscalo J. Homocysteine and atherothrombosis // New Engl J Med. // 1998. — 338 (15). — P. 1042-1050.

2. История вопроса.

В 1932 г. De Vigneaud открыл гомоцистеин как продукт деметилирования метионина. Через несколько лет был открыт и второй путь метаболизма гомоцистеина - транссульфурация. В 1962 г. был открыт синдром гомоцитеинурии (гомоцистеин в моче), связанный с дефицитом фермента цистатионин синтазы. При данном заболевании отмечаются умственная отсталость, деформации костей, смещение хрусталика, прогрессирующие сердечно- сосудистые заболевания и очень высокая частота тромбоэмболии.

Kilmer McCully углубленно изучал больных с высокими уровнями гомоцистеина в крови и обнаружил связь гипергомоцистеинемии с развитием тяжелых сосудистых заболеваний. Эти исследования послужили основой предложенной им в 1975 г. гомоцистеиновой теории атеросклероза. Он был убежден, что существует связь между уровнем гомоцистеина, витаминной недостаточностью и заболеваниями сердца.

Исследования последних 15 лет подтвердили и углубили гомоцистеиновую теорию развития сосудистых нарушений. (1)

1. Взято с сайта http://otherreferats.allbest.ru/medicine/00170910_0.html ссылка на первоисточник: http://www.cironline.ru/articles/162/92374/

3. Гомоцистеин, его роль в организме

Гомоцистеин является продуктом превращения метионина, одной из восьми незаменимых аминокислот. Метионин представляет особый интерес как источник метильных групп. Полученный с пищей, а также образованный в других тканях, метионин поступает в мозг через систему активного транспорта больших нейтральных аминокислот Метионин в пуле свободных аминокислот утилизируется на 80% для синтеза белка. (1)

1. Взято из итернет- источника http://www.bioinformer.ru/binfs-1054-1.html

Причины повышения уровня гомоцистеина в крови

В течение жизни уровень гомоцистеина в крови постепенно повышается. До периода полового созревания уровни гомоцистеина у мальчиков и девочек примерно одинаковы (около 5 мкмоль/л). В период полового созревание уровень гомоцистеина повышается до 6-7 мкмоль/л, у мальчиков это повышение более выражено, чем у девочек.

У взрослых уровень гомоцистеина колеблется в районе 10-11 мкмоль/мл, у мужчин этот показатель обычно выше, чем у женщин. С возрастом уровень гомоцистеина постепенно возрастает, причем у женщин скорость этого нарастание выше, чем у мужчин. Постепенное нарастание уровня гомоцистеина с возрастом объясняют снижением функции почек, а более высокие уровни гомоцистеина у мужчин - большей мышечной массой.

Во время беременности в норме уровень гомоцистеина имеет тенденцию к снижению. Это снижение происходит обычно на границе первого и второго триместров беременности, и затем остается относительно стабильным. Нормальные уровни гомоцистеина восстанавливаются через 2-4 дня после родов. Считается, что снижение уровня гомоцистеина при беременности благоприятстствует плацентарному кровообращению. Уровень гомоцистеина в крови обратно пропорционален массе плода и новорожденного.

Уровень гомоцистеина в крови может повышаться по многим причинам.

1. Повышенное поступление метионина с пищей. Поэтому во время беременности дополнительное назначение метионина в таблетках, до сих пор практикуемое некоторыми врачами, следует проводить с осторожностью и под контролем уровня гомоцистеина.

2. Витаминодефицитные состояния. Особенно чувствителен организм к недостатку фолиевой кислоты и витаминов B6, B12 и B1.

3. Курение.

4. Употребление большого количества кофе, у лиц, выпивающих более 6 чашек кофе в день, уровень гомоцистеина на 2-3 мкмоль/л выше, чем у не пьющих кофе, негативное действие кофеина на уровень гомоцистеина связано с изменением функции почек.

4. Гиподинамия, при сидячем образе жизни. Умеренные физические нагрузки способствуют снижению уровня гомоцистеина при гипергомоцистеинемии.

5. Употребление алкоголь, небольших количеств, может снижать уровень гомоцистеина, а большие количества спиртного способствуют росту гомоцистеина в крови.

6. Лекарственная терапия. Механизм их действия может быть связан с влиянием на действие витаминов, на продукцию гомоцистеина, на функцию почек, и на уровень гормонов. Особенное значение имеют: - метотрексат (антагонист фолиевой кислоты, часто применяется для лечения псориаза, медикаментозного лечения внематочной беременности, медикаментозного прерывания нежелательной беременности в ранних сроках); - противосудорожные препараты (фенитоин и др., опустошают запасы фолиевой кислоты в печени); - закись азота (препарат, использующийся при наркозе и при обезболивании родов, инактивирует витамин B12); -метформин (препарат, использующийся для лечения сахарного диабета и синдрома поликистозных яичников); - антагонисты H2-рецепторов (влияют на всасывание витамина B12); - эуфиллин (подавляет активность витамина B6, часто применяется в акушерских стационарах для лечения гестозов); - гормональных контрацептивы (но не всегда).

7. Сопутствующие заболевания (щитовидной железы – гипофункция, В12 – дефицитная анемия, сахарный диабет, псориаз и лейкозы)

8.Витаминодефицитные состояния (заболевания желудочно-кишечного тракта, соопровождающиеся нарушением всасывания витаминов (синдром мальабсорбции)). Это объясняет более высокую частоту сосудистых осложнений при наличии хронических заболеваний желудочно – кишечного тракта ЖКТ, а также то, что при B12-витаминодефиците частой причиной смерти служит не анемия, а инсульты и инфаркты

9. Почечная недостаточность.

10. Наследственная предрасположенность. Дефект фермента 5,10 метилентетрагидрофолат- редуктазы (MTHFR). MTHFR обеспечивает превращение 5,10-метилентетрагидрофолата в 5-метил-тетрагидрофолат, являющийся главной циркулирующей в организме формой фолиевой кислоты. В свою очередь, фолиевая кислота используется во многих биохимических путях, включая метилирование гомоцистеина и других веществ и синтез нуклеотидов. Ген MTHFR находится на первой хромосоме в локусе 1p36.3. Существует несколько аллельных вариантов этого фермента, вызывающих тяжелую недостаточность MTHFR, но большинство из этих вариантов очень редки. Практическое значение имеют два аллеля: термолабильный аллель C677T и аллель A1298C (иногда обозначается как C1298A). Аллель С677Т является результатом точечной мутации, при которой в позиции 677 аланин заменен на валин. При этом нормальный генотип обозначается как СС (на обеих хромосомах нормальные варианты гена), гетерозиготный - как СТ (носительство, на одной хромосоме - нормальный ген, а на другой - мутантный), гомозиготный по мутантному гену генотип - как TT (на обеих хромосомах мутантный ген). В настоящее время ДНК-диагностика мутации C677T проводится в некоторых медицинских центрах Москвы.

Сокращения: AdoMet, S-аденозилметионин; CHOTHF, формилтетрагидрофолат; CHTHF, метенилтетрагидрофолат; CH2THF, 5,10-метилентетрагидрофолат; CH3DNA, метилированная ДНК; CH3THF, 5-метилтетрагидрофолат; DHF, дигидрофолат; dTMP, диокситимидин-5’-монофосфат;dUMP, деоксиуридин-5’-монофосфат; FAD, флавинадениндинуклеотид; Hcy, гомоцистеин; Met, метионин; THF, тетрагидрофолат; protein, белок; DNA, ДНК; RNA, РНК; purines, пуриновые основания. CC и TT - гомозиготные генотипы, CT - гетерозиготный генотип.

При снижении активности фермента, 5-метилтетрагидрофолата может не хватать для эффективного перевода гомоцистеина в метионин, и гомоцистеин начинает накапливаться в организме.

11. Демографические факторы: возраст и пол.(у мужчин концентрация ГЦ несколько выше, чем у женщин).

Таблица 1 - Частые причины различных степеней гипергомоцистеинемии

Уровень гомоцистеина	Частота	Частые причины
Умеренное повышение (15-30 мкмоль/л)	10%	Нездоровый образ жизни, включая плохое и Полиморфизм MTHFR в сочетании с низким фолатным статусом (S-фолат на нижней границе нормы) Недостаток фолиевой кислоты Умеренный дефицит витамина B12 Почечная недостаточность Гиперпролиферативные нарушения Прием лекарств
Повышение средней степени тяжести (30-100 мкмоль/л)	<1%	Полиморфизм MTHFR в сочетании с дефицитом фолиевой кислоты Умеренный дефицит витамина B12 Тяжелый дефицит фолиевой кислоты Тяжелая почечная недостаточность
Повышение тяжелой степени (>100 мкмоль/л)	0,02%	Тяжелый дефицит витамина B12 Дефицит CBS (цистатионин- бета- синтаза) (гомозиготная форма)

Данные о причинах гомоцистеинемии и ее частоте даны на основании европейских исследований. Эти данные могут значительно варьировать в разных популяциях. Умеренное повышение гомоцистеина часто определяется даже на фоне приема больших доз витаминов, что может быть связано с высокой частотой нарушений усвоения витаминов в желудке и кишечнике. (1)

1.Взято из источника http://www.cironline.ru/articles/162/92374/

4.Метаболизм метионина и гомоцистеина.

Метаболизм свободного метионина до цистеина начинается с образования S-аденозилметионина, реакция катализируется метионин- аденозилтрансферазой. S-Аденозилметионин является главным донором метальных групп в мозге, необходимых для метилирования катехоламинов, гистамина, фосфатидилэтаноламина, нуклеиновых кислот.

Схема А

Схема Б

Схема В

Восстановление SH-групп часто происходит с использованием глутатиона - атипичного трипептида, содержащего γ-глутаминовую кислоту, цистеин и глицин (см. схему Г). Глутатион способен существовать в 2 формах - восстановленной (Г-SH) и окисленной (Г-S-S-F) и служит активным антиоксидантом в организме человека.

Ещё одним важным путём использования цистеина можно считать синтез таурина в животных тканях, который происходит путём декарбоксилирования производных цистеина - цистеиновой и цистеинсульфиновой кислот:

Схема № 2:

Таурин необходим для синтеза парных жёлчных кислот в печени. Кроме того, он очень важен в клетках как антиоксидант и используется для снижения перикисного окисления липидов (ПОЛ) и связывания гипохлоританиона (в форме хлораминового комплекса).

Цистеин также служит предшественником тиоэтаноламинового фрагмента HS-KoA (кофермента А). Катаболизм цистеина происходит окислительным путём (см. схему А).

Сульфит, который получается в реакции, превращается в сульфат и выводится с мочой, либо превращается в эфиро- серные кислоты, которые также экскретируются почками. Цистеин - практически единственный источник сульфатов мочи. Пути использования цистеина представлены на схеме (см. схему 2)

ГЦ не является структурным элементом белков, а потому не поступает в организм с пищей. В физиологических условиях единственным источником гомоцистеина в организме является превращение метионина, обладает выраженным токсическим действием на клетку. Для защиты клетки от повреждающего действия ГЦ существуют специальные механизмы выведения его из клетки в кровь. В случае появления избытка ГЦ в организме, он начинает накапливаться в крови, и основным местом повреждающего действия этого вещества становится эндотелий сосудов.

Для превращения избытка гомоцистеина в метионин нужны высокие концентрации активной формы фолиевой кислоты (5-метилтетрагидрофолата). Основным ферментом, обеспечивающим превращение фолиевой кислоты в ее активную форму, является 5,10 MTHFR.

Метионин, гомоцистеин и фолиевая кислота являются аминокислотами. Аминокислоты являются важнейшими субстратами метаболизма азота в организме. От аминокислот берут начало белки, ферменты, пуриновые и пиримидиновые основания (и нуклеиновые кислоты), пиррольные производные (порфирины), биологически активные соединения пептидной природы (гормоны), а также ряд других соединений. При необходимости аминокислоты могут служить источником энергии, главным образом за счет окисления их углеродного скелета.

Живые организмы не запасают аминокислоты и белки впрок, поэтому необходимое количество азота (лучше в форме аминокислот) должно поступать с пищей. Во взрослом организме в физиологических условиях количество поступающего и выводящегося азота одинаково (азотное равновесие). Аминокислоты из экзогенных источников (из пищи) всасываются в пищеварительном тракте и переносятся кровью в печень и другие ткани и органы, где они далее используются. Кроме того, источником аминокислот (эндогенный источник) могут служить тканевые белки организма, которые постоянно подвергаются метаболизму с освобождением входящих в них аминокислот. Эти аминокислоты используются для синтеза новых белков лишь в малой степени, однако эндогенные источники очень важны, поскольку они обеспечивают около двух третей всего пула аминокислот, и только одна треть аминокислот поступает из пищи.

Незаменимые аминокислоты - это те аминокислоты, которые не могут синтезироваться данным организмом. Для человека это валин, лейцин, изолейцин, лизин, метионин, треонин, фенилаланин, триптофан и, в определенных условиях, также аргинин и гистидин. (1)

1. Взято из интернет ресурса: http://biochemistry.ru/biohimija_severina/B5873Part74-494.html

5. Методы определения гомоцистеина в плазме. Новые подходы.

В плазме крови гомоцистеин присутствует в трех молекулярных формах: свободный гомоцистеин, дисульфид гомоцистеина (гомоцистин) и дисульфид гомоцистеина с цистеином. Все эти молекулярные формы гомоцистеина могут быть как в свободном виде, так и в связанном через дисульфидную связь с белком, главным образом, альбумином. У практически здоровых лиц концентрация свободного гомоцистеина очень низкая и его количество не превышает 2% от общего гомоцистеина в плазме крови. Содержание дисульфидов гомоцистеина (гомоцистина и цистеин - гомоцистеина) составляет примерно 10-15%.

Содержание общего гомоцистеина в плазме крови здорового человека находится в диапазоне 5-15 мкмоль/л. Концентрация 15-30 мкмоль/л соответствует умеренной, 30-100 мкмоль/л – средней, выше 100 мкмоль/л – тяжелой гипергомоцистеинемии. Однако полученные в последние годы результаты масштабных проспективных исследований показали, что уровень гомоцистеина 10-12 мкмоль/л у лиц старше 50 лет, при наличии сопутствующих заболеваний (сердечно-сосудистые заболевания, заболевания почек и др.) и некоторых других факторов риска следует квалифицировать как умеренную гипергомоцистеинемию.

Хотя иммунологические способы прямого определения гомоцистеина недоступны в связи с отсутствием доступных антител к гомоцистеину, был предложен ряд других способов определения гомоцистеина в клинических пробах. Все они предусматривают хроматографические разделения и обычно основаны на одном из следующих принципов: (1) классический хроматографический анализ аминокислот, (2) реакция гомоцистеина в пробе с ферментом S-аденозил -L- гомоцистеингидролазой в присутствии радиоактивно или иным способом меченого S- аденозина в качестве субстрата с последующим разделением и количественным определением образовавшегося продукта (S-аденозил-L-гомоцистеина, SAN). Как правило, применяют хроматографическое разделение (ЖХВР или тонкослойную хроматографию) и измерения радиоактивности (1)

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Взято с интернет ресурса http://erbalachema.ru/upload/file/articles/Hcy_artikle.pdf

( Шевченко Ольга Павловна, доктор мед. наук, профессор Зав. лабораторией клинической и экспериментальной биохимии ФГУ «НИИ Трансплантологии и искусственных органов Росздрава», Москва.)

Иммунологический метод (Метод антительной детекции).

В случае применения в способе по изобретению антител, они могут быть, поликлональными, но предпочтительно являются моноклональными. Если коммерческие антитела не доступны, их можно получить стандартными способами. Так, антитела можно получить в животных или в гибридомах, либо моноклональные, либо поликлональные, например, как описано James Gooding . Моноклоны должны быть подвергнуты сортировке для отбора клонов, которые различают целевой гаптен среди других субстратов для фермента (ферментов), например, которые различают аденозин и SAH. Поликлональные антитела, реактивные только с данным аналитом (например, с SAH) должны быть очищены для удаления перекрестно реагирующих антител, т.е. антител, реактивных с другими субстратами, кроме аналита, например, как с аденозином, так и с SAH. Это можно сделать при помощи афинной хроматографии, например, при помощи аденозина в случае, если аналитом является SAH.

При получении антител применяют в качестве гаптена либо сам аналит, либо другую молекулу, содержащую часть аналита, оцениваемую как наиболее подходящую область связывания, например, область, удаленную от областей участвующих в ферментативной реакции. Гаптен конъюгирован подходящим образом с макромолекулой, такой как бычий сывороточный альбумин (BSA) или гемоцианин. Для SAH целевой эпитоп находится предпочтительно у тиоэфирного мостика или вблизи его и, следовательно, хотя и можно использовать сам SAH

конъюгированный с макромолекулой, но все-таки предпочтительнее применять "упрощенную" молекулу, такую как молекула формулы I

где
R₁ и R₂ которые могут быть одинаковыми или различными, обозначают атомы водорода или OR₄-группы /где R₄ обозначает низшую, например, C_1-6, в частности, C_1-6, алифатическую группу, такую как алкил, предпочтительно метил или этил ( или R₁ и R₂ вместе обозначают атом кислорода, а R₃ обозначает амино- или карбоксигруппу) или его соль или эфир /например, с C_1-4-алканолом, также соединенные с макромолекулой. (1)

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Взято из интернет – ресурса http://www.findpatent.ru/patent/212/2121001.html

Иммуноферментный анализ (Разработка МГУ им. Ломоносова)

Получение коньюгатов гомоцистеина с БСА и ПАК.

1. Модификация белка и полимера 35мкМ ПАК растворить в 2,5мл даст воды, 25мг БСА(3,7нМ) рН довести до 5,0 + 74 мг (17,5 нМ) 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил) карбодиимид - инкубация 40 мин, 20°С активированный белок или полимер 2. Соединение с S-аденозил- b - гомоцистеином (SAH) активированный белок или полимер инкубация 3 суток, + 5 мг (ОДЗнМ) SAH J 20°С диализ против дист.воды, Коньюгаты SАН-ПАК и SAH- БСА.

Одной из главных задач при создании количественных иммунохимических методов анализа является приготовление калибровочных проб. В результате проведенных экспериментов было показано, что оптимально использовать для приготовления стандартов пулированные сыворотки крови, в которых концентрация определена разработанным методом и референтными (коммерческими) наборами реактивов (Abbot, США; Axis,Норвегия; Chiron Diagnostic, США). В качестве нулевой пробы применяли пул сывороток здоровых доноров, обработанный активированным углем (Norit A, Serva, Германия) с целью удаления витамина В12, фолатов, гомоцистеина.

Иммунохимический метод определения гомоцистеина

Широкие клинические исследования гомоцистеина стали возможны после разработки иммунохимических методов определения его концентрации. В основе большинства методов иммунохимического определения уровня общего гомоцистеина лежит использование моноклональных антител против S- аденозилгомоцистеина. Для этого сначала производят: восстановление гомоцистеина дитиотрейтолом; затем - энзиматическое превращение гомоцистеина в S-аденозилгомоцистеин; конкурентный иммунохимический анализ с использованием конъюгированного аденозилгомоцистеина и антител и различных методов детекции.

Энзиматический метод определения гомоцистеина. Компания «PLIVA-Lachema Diagnostika» предлагает набор для определения уровня общего гомоцистеина в сыворотке или плазме крови. Это простой, легко адаптируемый биохимический метод, позволяющий проводить анализ на любом биохимическом анализаторе вместе с определением других маркеров.

Принцип энзиматического метода определения концентрации гомоцистеина.

Связанный или димеризованный ГЦ (окисленная форма) восстанавливается до свободного гомоцистеина. Свободный ГЦ реагирует с серином, в результате чего образуется L- цистатионин. Реакция катализируется цистатионин- b - синтазой (ЦbС). L-цистатионин, в свою очередь, расщепляется с формированием гомоцистеина, пирувата и аммиака. Реакция катализируется цистатионин-b-лиазой.

Впоследствии пируват под действием лактатдегидрогеназы превращается в лактат, коферментом в этой реакции является NADH. Отношение NADH к NAD+ прямо пропорционально концентрации ГЦ. Общая схема химических реакций при энзиматическом методе определения концентрации гомоцистеина представлена ниже.

концентрации гомоцистеина представлена ниже.

Реакции:

Серин + Гомоцистеин цистатионин-b-синтазой ≥L-цистатионин

L-цистатионин цистатионин-b-синтазой ≥Гомоцистеин + Пируват + NH3

Пируват + NADH ЛДГ ≥Лактат + NAD+

Для определения концентрации гомоцистеина рекомендовано использовать свежую этилендиаминтетрауксусную кислоту ЭДТА или гепаринизированную плазму крови без гемолиза и мутности. Для сбора сыворотки можно использовать специальные сепараторные пробирки. При определении концентрации гомоцистеина в динамике у одного больного, не рекомендуется использовать и гепаринизированную, и ЭДТА плазму. Образцы крови необходимо поместить на лед сразу после сбора, они должны быть отцент-рифугированы в максимально короткие сроки (в течение 1 часа). Для проведения анализа не подходят сильно липемичные образцы. Образцы можно хранить при 2-80С в течение 48 часов, либо при необходимости их можно заморозить при –200С. Минимальная концентрация гомоцистеина, определяемая с помощью энзиматического метода, составляет 0,40 мкмоль/л.

Преимущества энзиматического метода.

В отличие от методов, в которых используются антитела, - это настоящий энзиматический метод определения концентрации гомоцистеина. Метод можно адаптировать к различным биохимическим анализаторам, поэтому анализ гомоцистеина можно проводить вместе с определением других маркеров. Небольшое количество манипуляций, что уменьшает вероятность ошибок, временные и трудовые затраты. Реагенты жидкие, стабильные, полностью готовы к использованию. Для проведения анализа используют только 3 реагента. Построение калибровки проводится всего по двум калибраторам, линейность калибровки до 90 мкмоль/л Широкий диапозон определяемых значений позволяет не проводить повторный анализ образцов с высокой концентрацией ГЦ. Реагенты можно хранить на борту анализатора. Стабильность реагентов на борту анализатора 30 дней. Для анализа можно использовать сыворотку, ЭДТА или гепаринизированную плазму крови. Нет необходимости использовать определенный вид образца. Быстрота проведения анализа: первый результат можно получить через 12 минут, скорость 36 тестов в час. Высокая воспроизводимость результатов.

Метод позволяет получать результаты, которые хорошо сходятся с результатами других исследований – высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и иммунохимического метода.

Определение гомоцистеина и цистеина в плазме/сыворотке крови методом Высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовой (УФ) детекцией и твердофазной экстракцией на полимерном сорбенте. Авторы: Дутов А.А., Никитин Д.А., Федотова А.А. (Дальневосточный государственный медицинский университет, 2010 г.)

Предложен ВЭЖХ метод определения гомоцистеина и цистеина в плазме/сыворотке с УФ детекцией при 330 нм и разделением на колонке 150x4,6 мм с октадецилсиликагелем (С18) в изократическом режиме с использованием в качестве элюента ацетонитрил - 0,05 М нитратно-фосфатный буфер с рН 2,4 – изопропанол. Полное разделение цистеина, цистеамина (IS), глутатиона и гомоцистеина занимает менее 10 мин. Восстановление тиолов из дисульфидных связей осуществляли 1,4-дитиоэритритолом, дериватизацию - реагентом Эллмана [5,5'-дитиобис-(2-нитробензойная кислота)]. После этого плазму/сыворотку с дериватами тиолов очищали и концентрировали на картридже с 10 мг сверхсшитого полистирола (Purosep-200). Элюирование с картриджа производили как водно-органическим растворителем (без упаривания и концентрирования, но без разбавления), так и безводными растворителями (с упариванием и концентрированием).

Простота, воспроизводимость в сочетании с высокой чистотой экстрактов и достаточной чувствительностью (0,4 нг для гомоцистеина, 2 нг для глутатиона и 0,2 нг для цистеина и цистеина при соотношении сигнал/шум > 3), делают метод пригодным для рутинного клинического применения. (1)

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Взято с интернет ресурса http://erbalachema.ru/upload/file/articles/Hcy_artikle.pdf

( Шевченко Ольга Павловна, доктор мед. наук, профессор Зав. лабораторией клинической и экспериментальной биохимии ФГУ «НИИ Трансплантологии и искусственных органов Росздрава», Москва.)

6.Гомоцистеин в акушерстве

Гипергомоцистеинемия приводит к повреждению и активации эндотелиальных клеток (клеток выстилки кровеносных сосудов), что значительно повышает риск развития тромбозов. Не все детали механизма патологического действия гипергомоцистеинемии до конца изучены, но многое уже известно.

Тромбогенное действие гомоцистеина может быть связано с повреждением клеток эндотелия, неспецифическим ингибированием синтеза простациклина, активацией фактора V, торможением активации протеина C, даун-регуляцией экспрессии тромбомодулина, блокадой связывания тканевого активатора плазминогена эндотелиальными клетками. Кроме того, высокие уровни гомоцистеина усиливают агрегацию тромбоцитов вследствие снижения синтеза эндотелием релаксирующего фактора и NO, индукции тканевого фактора и стимуляции пролиферации гладкомышечных клеток.

Микротромбообразование и нарушения микроциркуляции приводят к целому ряду акушерских осложнений. Нарушение плацентации и фетоплацентарного кровообращения могут быть причиной репродуктивной недостаточности: невынашивания беременности и бесплодия в результате дефектов имплантации зародыша. На более поздних стадиях беременности гипергомоцистеинемия является причиной развития хронической фетоплацентарной недостаточности и хронической внутриутробной гипоксии (дистресс) плода. Это приводит к рождению детей с низкой массой тела (гипотрофия) и снижению функциональных резервов всех жизнеобеспечивающих систем новорожденного и развития целого ряда осложнений периода новорожденности.

Гипергомоцистеинемия может быть одной из причин развития генерализованной микроангиопатии во второй половине беременности, проявляющейся в виде позднего токсикоза (гестоза): нефропатии, преэкламсии и экламсии. Для гипергомоцистеинемии характерно развитие тяжелых, часто неуправляемых состояний, которые могут приводить к досрочному прерыванию беременности по медицинским показаниям. Рождение незрелого недоношенного ребенка в таких случаях сопровождается высокой детской летальностью и большим процентом неонатальных осложнений.

Гомоцистеин свободно переходит через плаценту и может оказывать тератогенное и фетотоксическое действие и является одной из причин анэнцефалии и незаращения костномозгового канала (spina bifida). Нельзя исключить прямое токсическое действие избыточного уровня гомоцистеина на нервную систему плода.

Гипергомоцистеинемия может приводить к микротромбообразованию и нарушению маточного и фетоплацентарного кровообращения, что становиться причиной бесплодия и невынашивания беременности, инфарктов плаценты и ее преждевременной отслойки, развитию хронической фетоплацентарной недостаточности, хронической внутриутробной гипоксии плода, и как следствие, гипотрофии плода.

ГГЦ — один из факторов рождения детей с пороками развития (дефекты нервной трубки, косолапость). Также ГГЦ может сопровождаться развитием вторичных аутоиммунных реакций и в настоящее время рассматривается как одна из причин антифосфолипидного синдрома.

ГГЦ — ранний маркер клеточного функционального дефицита витаминов В-6, В-12 и фолиевой кислоты в большей степени, чем определение в крови самих этих витаминов.

Показанием для назначения анализа на гомоцистеин являются следующие положения, по мнению центра иммунологии и репродукции, всем женщинам, готовящимся к беременности, в обязательном порядке у пациенток с бывшими ранее акушерскими осложнениями и у женщин, у родственников которых были инсульты, инфаркты и тромбозы в возрасте до 45-50 лет. (1)

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Взято из источника http://www.cironline.ru/articles/162/92374/

7. Гомоцистеин в травматологии

В 60-х годах прошлого столетия ученые установили, что люди с генной мутацией сопровождающейся предельно высокими концентрациями аминокислоты гомоцистеина в крови склонны к заболеваниям сердца и деформациям костей.

Недавно получены новые данные о том, что мужчины с повышенным содержанием гомоцистеина в четыре раза чаще часто страдают переломами костей (у женщин частота уменьшается в два раза). Гомоцистеин изменяет структуру коллагена – основного протеина костей, связок, кожи и других соединительных тканей. Имеются данные о том, что гоцистеин улучшает связи между коллагеновыми волокнами и таким образом укрепляет структуру тканей. При увеличенной концентрации гомоцитеина эти связи ослабевают. (1)

Гомоцистеин воздействует также и на процессы тромбогенеза. С одной стороны, повреждение эндотелия способствует активации некоторых факторов гемостаза, с другой — гомоцистеин ингибирует экспрессию тромбомодул