Метаболизм и культивирование микроорганизмов.

Особенности питания бактерий состоят в том, что питательные вещества поступают через по­верхность клетки, метаболические процессы протекают очень быстро и также быстро они адапти­руются к меняющимся условиям среды.

Типы питания.Для нормального роста и размножения микробам, как и другим существам, нужны органогены (углерод, азот, водород и кислород). Источником водорода и кислорода являет­ся вода и некоторые газы (кислород, аммиак, сероводород). По усвоению углерода бактерии делят на аутотрофы и гетеротрофы. Аутотрофы используют углерод неорганических соединений (в том числе углекислоту), гетеротрофы (органотрофы) - углерод органических (углеводы, белки и др., которые часто добавляют в питательные среды для выращивания микробов). Микробы, усваиваю­щие мёртвые остатки органических и неорганических веществ, называют сапрофитами. Тех, которые живут за счет органических соединений животных или растений, относят к паразитам.

По усвоению азота бактерии делят на аминоаутотрофы (используют азот воздуха, азотофиксируюшие) и аминогетеротрофы (используют азот белковых соединений, среди них - все паразиты и многие сапрофиты). Многие микробы нуждаются дополнительно в факторах роста (витаминах, аминокислотах, пуринах и пиримидинах, микроэлементах), которые должны поступать в клетку из питательной среды в готовом виде.

Механизм питания.Поступление в клетку питательных веществ является сложным физико-химическим процессом, который может осуществляться посредством 4-х механизмов:

1) пассивная диффузия - если концентрация снаружи выше, чем внутри клетки (по градиенту концентрации);

2) облегчённая диффузия - с участием пермеаз, когда вещества поступают в неизменном виде (по градиенту концентрации);

3) активный транспорт - с участием пермеаз и в неизменённом виде, но обязательно с затратами энергии (АТФ), т.к. это перенос против градиента концентрации;

4) транслокация радикалов - с участием пермеаз идёт активный перенос химически изменённых молекул, т.к. в целом виде они не способны проходить через мембрану.

По источникам энергии различают фототрофы, которые используют энергию солнечного света, и хемотрофы, получающие энергию за счет химического окисления веществ.

Дыхание(биологическое окисление) у бактерий тесно связано с питанием и дает энергию для осуществления функций клетки. При этом в ходе биохимических реакций образуется АТФ - универсальный аккумулятор и переносчик химической энергии у живых существ. Различают аэробный и анаэробный типы дыхания. Микробы, окисляющие органические соединения с использованием кислорода воздуха (в качестве акцептора ионов Н+), называют аэробами. В отличие от них, анаэробы получают энергию в ходе окислительно-восстановительных реакций, при которых акцептором Н+ является не кислород, а нитрат или сульфат (в бескислородных условиях). Многие микробы, имея полный набор дыхательных ферментов, могут существоватькак в кислородной, так и бескислородной среде - это факультативные (необязательные) анаэробы с нитратным типом ды­хания. Облигагные (обязательные) анаэробы существуют лишь в строго анаэробных условиях, т.к. в аэробных условиях образуются токсичные перекиси (Н₂О₂ и др.), которые не разрушаются из-за отсутствия у облигатных анаэробов фермента каталазы, для них характерен сульфатный тип дыха­ния. Необходимыми условиями для культивирования микробов являются:

1) наличие подходящей по составу питательной среды;

2) оптимальной (по содержанию О₂ и др.) атмосферы над питательной средой;

3) оптимальной температуры.

Микробы, относимые к облигатным паразитам, наиболее требовательны к условиям выращи­вания. Многие из них (из-за отсутствия или дефекта собственных метаболических систем) могут размножаться только в живых клетках (вирусы, риккетсии, хламидии). Для их культивирования заражают животных, куриные эмбрионы или растущие в искусственной среде клетки эукариотов (культуры ткани). Многие микробы растут на естественных (молоко, картофель и т.д.) или искус­ственных питательных средах.

Питательные среды,предназначенные для культивирования микробов и изучения их свойств должны отвечать следующим требованиям:

1) достаток питательных веществ (источников органогенов, солей и т.д.);

2) стерильность (без этого трудно выделить чистую культуру, изучать ее свойства)

3) оптимальное значение рН и буферность (противодействие сдвигу рН);

4) оптимальный окислительно-восстановительный потенциал (например, для анаэробов - низкий);

5) изотоничность (как у 0,9% раствора хлорида натрия);

6) влажность (для плотных сред);

7) прозрачность (для жидких сред);

8) определенная вязкость для плотных и полужидких сред (зависит от количества добавляе­мого агар-агара).

Искусственные питательные среды делят на: простые (основные) и сложные. На простых сре­дах (пептонный бульон - ПБ, питательный агар - ПА растут многие микробы, их потребности удовлетворяются простым набором питательных веществ (мясной, рыбный или дрожжевой экстрат и пептон). Пептон является продуктом ферментативного расцепления белка, источником амино­кислот. В экстрактах, помимо аминокислот и пептидов, содержатся витамины, соли, микроэлемен­ты.

Сложные среды в зависимости от назначения делят на специальные, элективные (избиратель­ные) и дифференциально-диагностические; все они, как правило, содержат дополнительные ком­поненты. Специальные среды имеют добавки, обогащающие среду факторами роста, и предназна­чены для высокотребовательных микробов. Например, стрептококки не растут на ПА, для них нужны специальные среды - сахарный бульон (ПБ + глюкоза) или кровяной агар (ПА + кровь); ме­нингококки не растут на сахарном бульоне, но хорошо растут на сывороточном агаре (ПА + сыво­ротка крови). Стафилококки, кишечная палочка и другие менее требовательные микробы растут и на простых средах и на многих специальных.

На элективных средах растут микробы преимущественно одного вида. Рост других подавля­ется под влиянием специальных добавок (антибиотиков, жёлчи; щелочи и др.) или из-за обеднен­ного состава среды. Эти среды используют для выделения чистых культур или накопления микро­бов определенных видов (сальмонеллы-в желчном бульоне, стафилококки - в солевом бульоне, холерные вибрионы - на щелочной пептонной воде и т.д.).

На дифференциально-диагностических средах один вид микроба можно отличить от другого по характеру роста и биохимическим свойствам. Их также используют при выделении чистых культур из смеси микробов или при идентификации выделенной культуры. Например, в состав среды Эндо кроме питательной основы входит лактоза, и индикатор фуксин (обесцвеченный). Микробы, не ферментирующие лактозу, не изменяют цвет среды, а расщепляющие лактозу окра­шивают среду Эндо в красный цвет. Среды Гисса содержат набор углеводов и пептоны, которые предназначены для изучения сахаролитических и протеолитических ферментов в ходе идентифи­кации микробных культур.

Рост и размножение бактерийявляются результатом биосинтеза клеточных компонентов. Рост - это увеличение размеров особи и воспроизведение всех её структур. Размножение бактерий происходит путем бинарного деления. Перед делением в клетке удваивается нить ДНК и обе копии генома равномерно распределяются между двумя дочерними клетками. Время от одного деления до другого (время генерации) составляет у многих микробов 20-30 мин, v некоторых - до 20-30 ч (микробактерии туберкулёза) или более. Особенности роста и размножения микробов, их культуральные свойства, учитывают при идентификации, в производстве вакцин и биопрепаратов из микробов. Культуральными свойствами называют способность микробов расти на определенных средах с образованием характерного роста (скоплений). По мере размножения в жидкой среде одни микробы образуют помутнение, другие - плёнку или осадок, которые могут появиться уже через 8-24 ч после посева. На плотной среде в месте посева (на поверхности или внутри питательного агара) бактерии могут образовывать типичные колонии; макроскопические скопления микробов одного вида - потомство одной микробной клетки. У разных микробов колонии отличаются по раз­меру, форме, рельефу, прозрачности, консистенции и цвету. Окрашенность микробных скоплений связана со способностью некоторых видов на свету продуцировать пигменты. Среда них известны водорастворимые (пиоцианин синегнойной палочки, окрашивает и колонии и среду), растворимые в органических растворителях (продигиозан серрацицй) и нерастворимые пигменты (липохромы стафилококков). Пигменты могут защищать бактерии от действия солнечной энергии, обладать антимикробным действием.

В процессе роста и размножения микробы могут продуцировать токсины, витамины, аминокислоты, ароматические и многие другие вещества в значительных количествах. Это используется при биотехнологическом получении полезных для человека продуктов микробного синтеза. В ходе культивирования на плотных питательных средах может осуществляться выделение чистых культур бактерии, которое должно предшествовать их идентификации. Для этого обычно при посеве механически разобщают (распределяют) микробные клетки по поверхности или в глубине плотной питательной среды. В результате такого посева на месте отдельно лежащих клеток образуются изолированные колонии. Часть такой колонии отсевают на новую питательную среду для накопления выделенной чистой культуры.

Выделение чистой культуры бактерий-аэробов занимает 3 дня:

1. день:

а) микроскопия мазка из материала (для ориентировочного суждения о составе микрофлоры);

б) посев материала на ПА в чашке истощающим штрихом (для получения изолированных
колоний);

в) инкубирование в термостате (37⁰С) 18-20 часов

2. день:

а) изучение и выбор изолированных колоний;

б) микроскопия мазков из изолированных колоний для суждения об однотипности микробов в колонии;

в) пересев остатка колонии на скошенный ПА (для получения чистой культуры);

г) инкубирование в термостате (37°С). 18-20 часов

3. день:

а) микроскопия мазков из чистой культуры на скошенном ПА (для контроля чистоты просматривают не менее 40 полей зрения должны быть однотипные по морфологии микроорганизмы);

б) изучение других свойств выделенной чистой культуры.

Выделение чистой культуры анаэробов занимает 4 дняи отличается тем, что исследова­ние ведут в анаэробных условиях на специальных средах и материал предварительно подращивают сутки в среде для накопления анаэробов. Методы культивирования анаэробов основаны на удале­нии кислорода из питательной среды и из атмосферы (используют механическое и физическое удаление или замещение, химическое или биологическое связывание О₂)

- перед посевом среды регенерируют (кипятят и быстро охлаждают);

- делают посевы в высокие столбики среды в пробирках;

- наслаивают поверх питательной среды вазелиновое масло;

- культивируют в анаэроостате, из которого откачан воздух и замещён инертным газом или бескислородной смесью (азот, водород, углекислый газ);

- культивируют в эксикаторе, на дно которого помещены химические поглотители кислорода (щелочной раствор пирогаллола и др.);

- культивируют в герметично закрытой чашке с плотной средой, на две половины которой отдельно засевают анаэробы и аэробы, которые в ходе размножения поглощают кислород (метод Фортнера).

ГЕНЕТИКА БАКТЕРИЙ

Микроорганизмы послужили удобной моделью для генетических исследований приведших к важнейшим открытиям 21 века в биологии: показано, что материальным носителем (основой)наследственности являются нуклеиновые кислоты - ДНК и РНК; установлено детальное строение хромосомы; расшифрованы механизмы генетического обмена и его регуляции, достижения генетики микроорганизмов послужили основой для становления и развития новой перспективной отрасли - биотехнологии. Она призвана использовать свойства микробов и клеточныхкультур, биологических процессов в производстве: биологически-активных веществ (антибиотиков, гормонов, белков, аминокислот), энергоносителей, полезных новых видов микробов, сортов растений, видов животных, эффективных вакцин, а также в борьбе с загрязнением окружающей среды и болезнями растений.

Микробы как объекты генетических исследований, обладают рядом преимуществ: бактерии содержат гаплоидный набор генов, поэтому изменения их генотипа с неизбежностью влекут за со­бой изменение фенотипа; для них характерно быстрое размножение и огромная численность по­томства (быстрая смена поколений); работа с микробами не требует больших затрат.