Динамический анализ функции тромбоцитов

Новым подходом в лабораторной диагности­ке является имитирование тромбоцитарного гемо­стаза на приборе PFA-100® (фирма «Dade Behring», Германия). В PFA-100 в измерительном картрид­же цитратная кровь пропускается через капилляр диаметром 150 мкм, моделирующий микрососуд, покрытый пленкой из коллагена/адреналина или коллагена/АДФ (рис. 73-74). Это сопровождается образованием тромбоцитарной пробки, что оце­нивается по перфузионному давлению. Останов­ка перфузии фиксируется как «время окклюзии сосуда». Метод позволяет эффективно с высокой чувствительностью и специфичностью выявлять дефицит фактора Виллебранда, функциональные нарушения тромбоцитов, вызванные аспирином, наследственные и приобретенные нарушения ад­гезии и агрегации тромбоцитов. С применением

2 агонистов (индукторов агрегации) возможно се­лективное выделение аспириновых тромбоцитопа-тий. По типу измерения PFA-100 является дина­мическим агрегометром.

На практике трудно наработать материал с первичным нарушением гемостаза, чтобы уста­новить референтные значения теста, так как боль­ных с однородными нарушениями достаточно мало. При тромбоцитопатиях, вызванных дли­тельным приемом антитромбоцитарных препара­тов, очень много различных вариантов измене­ний первичного гемостаза. Тем не менее метод по­зволяет выявлять ранние признаки нарушений первичного гемостаза и, по-видимому, имеет большие перспективы для внедрения в коагуло-логические лаборатории и лаборатории экспресс-диагностики.

Рис. 73. Динамический агрегометр PFA-1OO.Он позво­ляет наблюдать in vitro за процессом закупорки сосуда при моделировании этого процесса в специально созданном картридже. Образование тромбоцитарной пробки оцени­вается по перфузионному давлению

Рис. 74. Датчик динамического агрегометра PFA-1OOсо­держит капилляр, моделирующий микрососуд. В цельной кро­ви, проходящей по капилляру, активируется образование сгу­стка, На стенках нанесен коллаген и адреналин или АДФ, которые являются первичной причиной запуска гемостаза

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Тромбоцитарные показатели

Число тромбоцитов (Platelets, PL, PLT)

При подсчете на автоматических анализато­рах тромбоциты распознаются по размерам в ди­апазоне 2-20 фл (рис. 75). Автоматические счет­чики позволяют получать достаточно надежные результаты по количеству тромбоцитов. При под­счете тромбоцитов в камере Горяева коэффици­ент вариации составляет 7-15%, тогда как авто­матический подсчет воспроизводится с точностью до 2-4%. Современные анализаторы сигнализи­руют (флагирование на бланке) о выходе количе­ства тромбоцитов за референтные пределы, на­личии агрегатов тромбоцитов, макротромбоци­тов или других элементов, сравнимых по объему с тромбоцитами (микроэритроциты).

Ложное занижение числа тромбоцитов может быть при их агрегации, агглютинации под дей­ствием тромбоцитарных агглютининов и при прилипании тромбоцитов к лейкоцитам (тромбо-цитарный «сателлитизм»). При подсчете на гема­тологических анализаторах в качестве антикоа­гулянта используется ЭДТА. При наличии ауто-антител к тромбоцитам калиевая соль ЭДТА ини­циирует агрегацию тромбоцитов, что проявляет­ся псевдотромбоцитопенией.

Средний объем тромбоцита (MPV)

У здоровых людей MPV равен 6-12 фл и нахо­дится в обратной зависимости от числа тромбо­цитов. Такое соотношение определяет постоянство тромбоцитарной массы в циркулирующей крови. MPV увеличивается с возрастом; отмечено, что у мужчин MPV несколько выше, чем у женщин.

Использование ЭДТА в качестве антикоагу­лянта вызывает изменение формы тромбоцитов от диска к сфере, что приводит к увеличению MPV на 10-12% в течение 2 часов, а затем показатель существенно не меняется. Под действием цитрата натрия MPV может уменьшаться или увеличивать­ся, а при высокой концентрации (1:4) - не изменя­ется со временем. Кроме типа применяемого ан­тикоагулянта и времени от момента взятия пробы до исследования, на MPV оказывает влияние тем­пература окружающей среды. Преходящее увели­чение MPV отмечается у рабочих, контактирую­щих с асфальтовыми испарениями, органически­ми растворителями. MPV - важный диагностичес­кий показатель функции тромбоцитов. Причины изменения MPV представлены в табл. 13.

Таблица 13

Причины изменения MPV

Рис. 75. Гистограмма тромбоцитов,которая изобража­ется при представлении результатов счета клеток крови на гематологических анализаторах, Помимо гистограммы, ге­матологические анализаторы представляют результаты подсчета количества тромбоцитов (PLT), среднего объема тромбоцитов (MPV), дисперсии распределения тромбоци­тов по объему (PDW), тромбоцитокрита (РСТ)

Дисперсия распределения тромбоцитов по объему (PDW)

PDW - показатель, являющийся мерой ге­терогенности размеров (анизоцитоза) тромбо-

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

мов тромбоцитов или произведением среднего объема тромбоцитов на их число:

цитов. Величина PDW в среднем составляет 10-15%.

Как артефакт, ложнозавышенное увеличение PDW может быть связано с присутствием микро-цитов, шизоцитов, микроагрегатов тромбоцитов, фрагментов цитоплазмы лейкоцитов.

Этот показатель находится в обратной зави­симости от числа тромбоцитов и их периода жиз­ни. В каждом конкретном случае важна не толь­ко величина PDW, но и ее динамика во времени, а также связь с другими тромбоцитарными по­казателями. Так, увеличение PDW с одновремен­ным снижением MPV свидетельствует о преоб­ладании микротромбоцитов среди общей попу­ляции тромбоцитов (указывает на угнетение тромбоцитопоэза), а сочетание повышенного PDW с увеличением MPV отражает нарастание числа макротромбоцитов (усиление продукции тромбоцитов). Одновременное присутствие фракций макротромбоцитов и микротромбоци­тов ведет к увеличению PDW, но MPV может ос­таваться в пределах нормы. В современных ге­матологических анализаторах отдельными пока­зателями указывается процентное содержание микротромбоцитов (MicroPLT) и макротромбо­цитов (MacroPLT).

PDW может применяться для дифференци­альной диагностики. Так, увеличение PDW свы­ше 10,5% было обнаружено у 50% больных эссен-циальной тромбоцитемией, у 21% пациентов с ре­активным тромбоцитозом и лишь у 14% здоро­вых людей.

Тромбоцитокрит (РСТ)

РСТ - показатель, характеризующий процент тромбоцитарной массы в объеме крови: вычис­ляется суммированием прямо измеренных объе-

У здорового человека показатель стремится остаться стабильным: при уменьшении числа тром­боцитов усиливается тромбопоэз, в циркулирую­щую кровь выбрасывается большее число моло­дых макротромбоцитов, что ведет к увеличению MPV. При увеличении количества циркулирую­щих тромбоцитов снижается продукция их в кост­ном мозге, тем самым уменьшается процент мак­ротромбоцитов и MPV уменьшается. Однако при нарушении этого равновесия происходит или уменьшение РСТ, что в конечном счете приводит к патологии первичного гемостаза и риску возник­новения кровотечений, или повышение РСТ, уве­личивающее активность тромбоцитов и их способ­ность к агрегации. Это повышает риск тромбозов.

Нормальные значения РСТ варьируют в пре­делах 0,15-0,35%. Было обнаружено, что сниже­ние РСТ менее 0,1% обусловило возникновение послеоперационных кровотечений у пациентов с развившейся тромбоцитопенией. Также было от­мечено, что этот показатель оказался более чув­ствительным для оценки риска возникновения кровотечения, чем число тромбоцитов.

Если скрининговые методы указывают на нарушение функции тромбоцитов, необходимо выполнить специальные тесты с учетом диеты и лекарственных препаратов, принимаемых паци­ентом (отмена за 7-10 суток перед исследовани­ем глюкокортикостероидов, аспирина и других нестероидных противовоспалительных средств, адреноблокаторов, блокаторов кальциевых кана­лов, антиагрегантов: пентоксифиллина, папаве­рина, теофиллина, дипиридамола, тиклопидина, антибиотиков - пенициллина, карбенициллина).

Агрегация тромбоцитов

Агрегацию тромбоцитов исследуют на агре-гометре с использованием индукторов агрегации. Требования к пробам критичны. Исследование агрегации проводят на плазме, богатой тромбо­цитами (ПБТ, английская аббревиатура PRP). Желательно использовать ПБТ, содержащую примерно 200 клеток/нл. Это требование затруд-

няет оценку агрегации тромбоцитов при тромбо-цитопении.

Пробы помещаются в кювету агрегометра, который представляет собой оптический прибор с регистрацией проходящего света. Проба в кю­вете постоянно перемешивается специальной ме­шалкой. При формировании агрегатов повыша-

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

ется прозрачность плазмы и, следовательно, уве­личивается поток проходящего через кювету све­та (рис. 76). Изменение светопропускания регис­трируется в виде кривой.

Агрегация с АДФ

Характер агрегации тромбоцитов при ин­дукции АДФ зависит от дозы. Как правило, при концентрации 0,5-1 мкмоль возникает обрати­мая агрегация, при концентрации до 5 мкмоль -двухфазная агрегация, при большей концентра­ции (до 10 мкмоль) - необратимая однофазная агрегация (или агрегация, при которой неразли­чим переход от 1-й до 2-й волны).

При связывании на поверхности тромбоци­тов АДФ с рецептором происходит изменение формы тромбоцитов, экспозиция на мембране комплекса GPIIb-IIIa (рецептор для фибриноге­на) и первичная Са-зависимая агрегация. Если первичный ответ на АДФ не будет поддержан вторичной реакцией, то в отсутствии фибриноге­на происходит десенситизация рецепторов, кото­рая приводит к дезагрегации тромбоцитов. Вто­ричная агрегация опосредована внутриклеточной передачей сигнала через G-белки с повышением внутриклеточной концентрации Са²⁺. Происхо­дит активация простагландин-тромбоксановой системы, развивается секреция из α-гранул vWF, β-тромбоглобулина, тромбоспондина, фибронек-тина и других активных компонентов, развива­ется вторичная агрегация.

Выяснение путей АДФ-активации тромбоци­тов позволило использовать в клинике антиагре-гационные соединения. Оказалось, что тиклопи-

дин и клопидогрель селективно ингибируют ак­тивацию G-белка, АДФ-агрегацию и активность стимулированной аденилатциклазы.

Агрегация с адреналином

Особенности агрегации с адреналином в зна­чительной степени обусловлены концентрацией Са²⁺ в среде. При физиологических концентра­циях Са²⁺ (1-2 ммоль, которая характерна для плазмы крови) адреналин не вызывает актива­ции тромбоцитов и их агрегации. При значи­тельном снижении Са²⁺ в цитратной плазме до 20-40 мкмоль адреналин вызывает дозозависимую агрегацию с экспрессией комплекса GPIIb-IIIa при первичной волне агрегации и ТХА₂-опосре-дованную вторичную волну (рис. 28).

По-видимому, в условиях организма прямая адреналиновая агрегация отсутствует, что связа­но с относительно высокой концентрацией Са²⁺ в плазме и низкой концентрацией самого адрена­лина. Однако адреналин, очевидно, потенцирует действие других агонистов, что проявляется уже при его концентрации порядка 0,01 мкмоль. По­этому при курении, стрессе и особенно кардио-генном шоке, когда уровень адреналина в крови повышается до 0,6 мкмоль, он становится суще­ственным фактором внутрисосудистой агрегации тромбоцитов.

Агрегация с тромбином

Тромбин - очень сильный физиологический индуктор агрегации. Воздействие тромбина на тромбоцит опосредовано собственным рецепто-

Рис. 76. Принцип оценки индуцированной агрега­ции. А- до агрегации; Б -агрегация. После добавле­ния индуктора агрегации и формирования агрегатов тромбоцитов происходит просветление суспензии

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

ром (рис. 20) и GPIbα. Стимуляция тромбиново-го рецептора сопровождается активацией тром­боцитов через G-белок, фосфолипазы С и вклю­чение фосфоинозитольного механизма актива­ции. Этот путь сопровождается быстрым увели­чением концентрации цитозольного Са²⁺ и сек­рецией α-гранул и электронно-плотных 5-гранул. Секретируемый из 5-гранул АДФ существенен для образования агрегатов, а выделяемые α-гра-нулами фибриноген, vWF, тромбоспондин - для их стабилизации. Оккупация молекулами тром­бина высокоаффинных рецепторов GPIbα приво­дит к перестройке фосфолипидной мембраны, стимуляции ее прокоагулянтной активности и повышению аффинности GPIIb-IIIa. В результа­те комплексной стимуляции тромбином практи­чески не наблюдается двухволновой агрегации.

Агрегация с арахидонатом

Арахидоновая кислота в цитратной плазме вызывает дозозависимое изменение формы тром­боцитов, первичную и вторичную агрегацию. Арахидонат активирует тромбоциты без участия специфических рецепторов, проникая внутрь клетки, активируя свои метаболиты - ПГG₂,

ПГН₂ и тромбоксан. Эту особенность активации тромбоцитов арахидоновой кислотой использу­ют для дифференциации нарушений, связанных с дефицитом пулов хранения и нарушениями в цик-лооксигеназном пути активации тромбоцитов.

Вид агрегатограммы зависит от типа и концен­трации индуктора. Наиболее распространенные индукторы АДФ и адреналин используются в не­скольких концентрациях. Форма агрегатограммы может быть несколько отлична на агрегометрах разных производителей, так как выводимый резуль­тат теста в определенной степени зависит от скоро­сти и характера перемешивания, температуры, спо­соба регистрации и некоторых других факторов.

Лекарственные средства, такие, как аспирин и другие нестероидные противовоспалительные препараты, антибиотики (3-лактамного ряда, не­которые витамины, пряности могут быть причи­ной нарушенной агрегации. Из вышесказанного следует, что для адекватной оценки результатов теста требуется тщательная стандартизованная подготовка больных и стандартизация протоко­ла аналитических процедур.

Болезнь Виллебранда и врожденные наруше­ния функции тромбоцитов легко диагностируют­ся агрегатометрией (табл. 14).

Изменения агрегатограмм при нарушениях функции тромбоцитов

Таблица 14

Н- нормальная агрегатограмма, 4- - сниженная реакция на индуктор агрегации.

Клинический пример 2

Мальчик А. 6 лет. Обратился за помощью по поводу носового кровотечения. Со слов ро­дителей - единственный ребенок в семье, име­ющий геморрагические проявления в виде кож­ного гемосиндрома, гемартрозов и носовых кровотечений. Ребенок наблюдается по месту

жительства с диагнозом гемофилия А. При но­совых кровотечениях и гемартрозах получает переливания цельной крови с положительным эффектом. При осмотре, помимо кровотечения из полости носа, выявлен кожный гемосиндром смешанного типа - гематомы, экхимозы, пете-хии и пурпурозные элементы. Для оказания эк­стренной помощи был введен концентрат фак-

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

тора VIII, после чего кровотечение останови­лось, однако рецидивировало через несколько часов. С учетом характера кожного гемосинд-рома диагноз гемофилии А вызвал сомнения. Необходимо было проводить дифференциаль­ный диагноз между коагулопатией, болезнью Виллебранда и нарушением тромбоцитарного гемостаза. Было проведено коагулологическое обследование.

Результаты: время кровотечения значитель­но удлинено, количество тромбоцитов 150 х 10⁹/л. ПТ-тест 155%, АЧТВ 31 с (норма 28-43 с), ф.УШ >200%, ф.1Х 195%, ристоцетин-кофакторная ак­тивность 71%. Агрегация тромбоцитов с АДФ, коллагеном и адреналином отсутствует, агрегация тромбоцитов с аггристином нормальная. Данные обследования позволили поставить диагноз: тромбастения Гланцмана.