Схема титрования гемолитической сыворотки
┌────────────────┬──────────────────────────────────────────────────────┐
│ Ингредиенты │ Разведение гемолитической сыворотки │
│ опыта │ │
│ ├──────────┬──────────┬──────────┬──────────┬──────────┤
│ │ 1:1000 │ 1:1200 │ 1:1600 │ 1:1800 │ 1:2000 │
├────────────────┼──────────┼──────────┼──────────┼──────────┼──────────┤
│ Гемолитическая │ │ │ │ │ │
│ сыворотка (мл) │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │
├────────────────┼──────────┼──────────┼──────────┼──────────┼──────────┤
│ 3% взвесь │ │ │ │ │ │
│ бараньих эри- │ │ │ │ │ │
│ троцитов (мл) │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │
├────────────────┼──────────┼──────────┼──────────┼──────────┼──────────┤
│ Комплемент в │ │ │ │ │ │
│ разведении │ │ │ │ │ │
│ (мл) │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │
├────────────────┼──────────┼──────────┼──────────┼──────────┼──────────┤
│ Физ. │ │ │ │ │ │
│ раствор (мл) │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2 │
├────────────────┼──────────┼──────────┼──────────┼──────────┼──────────┤
│ Оценка │ │ │ │ │ │
│ результатов │ │ │ │ │ │
│ опыта │ - │ - │ - │ - │ ++ │
└────────────────┴──────────┴──────────┴──────────┴──────────┴──────────┘
┌────────────────┬──────────────────────────────────────────────────────┐
│ Ингредиенты │ Разведение гемолитической сыворотки │
│ опыта ├──────────┬──────────┬──────────┬──────────┬──────────┤
│ │ 1:2400 │ 1:2800 │ 1:3000 │ 1:3200 │ 1:3600 │
├────────────────┼──────────┼──────────┼──────────┼──────────┼──────────┤
│ Гемолитическая │ │ │ │ │ │
│ сыворотка (мл) │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │
├────────────────┼──────────┼──────────┼──────────┼──────────┼──────────┤
│ 3% взвесь │ │ │ │ │ │
│ бараньих эри- │ │ │ │ │ │
│ троцитов (мл) │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │
├────────────────┼──────────┼──────────┼──────────┼──────────┼──────────┤
│ Комплемент в │ │ │ │ │ │
│ разведении │ │ │ │ │ │
│ (мл) │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │
├────────────────┼──────────┼──────────┼──────────┼──────────┼──────────┤
│ Физ. │ │ │ │ │ │
│ раствор (мл) │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2 │
├────────────────┼──────────┼──────────┼──────────┼──────────┼──────────┤
│ Оценка │ │ │ │ │ │
│ результатов │ │ │ │ │ │
│ опыта │ ++ │ ++ │ ++ │ ++ │ ++ │
└────────────────┴──────────┴──────────┴──────────┴──────────┴──────────┘
Титр гемолитической сыворотки 1:1800.
Для получения эритроцитов барана, кровь, взятую из яремной вены животного, дефибринируют во флаконе со стеклянными круглыми бусами путем встряхивания в течение 10 - 15 минут, процеживают через стерильную марлю и хранят в холодильнике при температуре от 0 до +4°С. Перед опытом дефибринированную кровь многократно отмывают при центрифугировании физиологическим раствором (до исчезновения следов гемолиза) и готовят взвесь эритроцитов. Эритроциты хранят обычно в течение 1 месяца в консерванте "Консервант крови N 7Б", выпускаемом Пензенским заводом медицинских препаратов или каком-либо другом консерванте.
1-я схема постановки РСК.
Титрование комплемента. Постановке основного опыта РСК предшествует титрование комплемента с целью определения его рабочей дозы. Тирование комплемента ведут в присутствии антигена. Из основного разведения комплемента 1:10 готовят различные дозы в 1 мл (таблица 2).
Таблица 2
┌──────────────┬────────────────────────────────────────────────────────┐
│Ингредиенты │ Дозы комплемента │
│ реакции ├─────┬─────┬─────┬─────┬──────┬──────┬─────┬──────┬─────┤
│ │ 1 │ 2 │ 3 │ 4 │ 5 │ 6 │ 7 │ 8 │ 9 │
├──────────────┼─────┼─────┼─────┼─────┼──────┼──────┼─────┼──────┼─────┤
│Комплемент в │ │ │ │ │ │ │ │ │ │
│ разведении │ │ │ │ │ │ │ │ │ │
│ 1:10 (мл) │ 0,1 │ 0,2│ 0,3 │ 0,4│ 0,5│ 0,6│ 0,7│ 0,8 │ 0,9 │
├──────────────┼─────┼─────┼─────┼─────┼──────┼──────┼─────┼──────┼─────┤
│Физиологи- │ │ │ │ │ │ │ │ │ │
│ческий │ │ │ │ │ │ │ │ │ │
│раствор (мл) │ 0,9 │ 0,8│ 0,7 │ 0,6│ 0,5│ 0,4│ 0,3│ 0,2 │ 0,1 │
└──────────────┴─────┴─────┴─────┴─────┴──────┴──────┴─────┴──────┴─────┘
Затем ставят опыт титрования комплемента.
Таблица 3
┌──────────────┬────────────────────────────────────────────────────────┐
│ Ингредиенты │ Дозы комплемента │
│ реакции ├─────┬─────┬─────┬─────┬──────┬──────┬─────┬──────┬─────┤
│ │ 1 │ 2 │ 3 │ 4 │ 5 │ 6 │ 7 │ 8 │ 9 │
├──────────────┼─────┼─────┼─────┼─────┼──────┼──────┼─────┼──────┼─────┤
│Комплемент в │ │ │ │ │ │ │ │ │ │
│ различных │ │ │ │ │ │ │ │ │ │
│дозах (мл) │ 0,1 │ 0,1│ 0,1 │ 0,1│ 0,1│ 0,1│ 0,1│ 0,1 │ 0,1 │
├──────────────┼─────┼─────┼─────┼─────┼──────┼──────┼─────┼──────┼─────┤
│Антиген (мл) │ 0,1 │ 0,1│ 0,1 │ 0,1│ 0,1│ 0,1│ 0,1│ 0,1 │ 0,1 │
├──────────────┼─────┼─────┼─────┼─────┼──────┼──────┼─────┼──────┼─────┤
│Физиологичес- │ │ │ │ │ │ │ │ │ │
│кий раствор │ │ │ │ │ │ │ │ │ │
│ (мл) │ 0,1 │ 0,1│ 0,1 │ 0,1│ 0,1│ 0,1│ 0,1│ 0,1 │ 0,1 │
├──────────────┼─────┼─────┼─────┼─────┼──────┼──────┼─────┼──────┼─────┤
│Гемолитическая│ │ │ │ │ │ │ │ │ │
│ система (мл) │ 0,2 │ 0,2│ 0,2 │ 0,2│ 0,2│ 0,2│ 0,2│ 0,2 │ 0,2 │
├──────────────┼─────┼─────┼─────┼─────┼──────┼──────┼─────┼──────┼─────┤
│Оценка резуль-│ │ │ │ │ │ │ │ │ │
│ татов │ 4+ │ 3+ │ 2+ │ + │ - │ - │ - │ - │ - │
└──────────────┴─────┴─────┴─────┴─────┴──────┴──────┴─────┴──────┴─────┘
Оттитрованный комплемент ставят в термостат при +37°С на 1 час. Через час добавляют гемолитическую систему, состоящую из равных объемов 3% взвеси эритроцитов барана в физиологическом растворе и гемолитической сыворотки в тройном титре (выдержанную предварительно в термостате в течение 30 минут), и через 30 минут производят учет результатов.
Оценка результатов титрования комплемента заключается в определении степени задержки гемолиза: отсутствие гемолиза (полная его задержка) обозначается четырьмя крестами (++++); почти полная задержка (следы гемолиза) обозначается тремя крестами (+++); частичная задержка гемолиза оценивается двумя крестами (++) и, наконец, следы задержки (почти полный гемолиз) - одним крестом (+).
Единицей комплемента считают то наименьшее ее количество, которое вызывает полный гемолиз эритроцитов. В приведенном примере эта единица соответствует 5-й дозе. За полную единицу комплемента принимают вторую пробирку полного гемолиза, в данном примере - 6-я доза. Рабочая доза комплемента равна одной полной единице комплемента при проведении связывания в термостате при +3°С в течение 1 часа.
Постановка основного опыта.
1 этап. Инактивированные испытуемые сыворотки разводят обычно двукратно в пределах 1:10 - 1:640 и выше в зависимости от срока болезни физиологическим раствором и разливают по 0,1 мл. К различным разведениям их добавляют по 061 м; антигена и комплемента в рабочих дозах.
К каждому опыту ставят следующие контроли:
1) контроль всех испытуемых сывороток (0,1 мл сыворотки в исходном разведении +0,1 мл физиологического раствора + 0,1 мл комплемента в рабочей дозе);
2) контроль антигена (0,1 мл антигена + 0,1 мл физиологического раствора. 0,1 мл комплемента в рабочей дозе);
3) контроль комплемента (0,1 мл комплемента в рабочей дозе + 0,2 мл физиологического раствора);
4) контроль гемолитической системы (0,3 мл физиологического раствора);
5) контроль заведомо положительной сыворотки, которую титруют до ее титра;
6) контроль заведомо отрицательной сыворотки, которую титруют 2???? разведениях (1:10 - 1:40), включая так же как и для п. 5 контроля сывороток в исходных разведениях.
После добавления всех указанных ингредиентов и тщательного встряхивания пробирки ставят в термостат при + 37°С на 1 час.
2 этап. Вынимают пробирки из термостата и добавляют в каждую по 0,2 мл гемолитической системы (предварительно выдержанной в термостате 30 минут). Опять тщательно встряхивают и ставят пробирки в термостат на 20 - 30 минут в зависимости от гемолиза эритроцитов в контролях.
2-я схема постановки РКС (по Fiset).
Указанная схема отличается от первой общим объемом реакции - 0,6 мл упрощенным титрованием комплемента, которое проводится при температуре +4°С 16 - 18 часов не в день постановки реакции, 1 - 2 раза на протяжении месяца при условии работы с одной серией эритроцитов и комплемента: сухого или нативного, взятого у морских свинок и хранящегося при температуре не выше - 20 С (однако размороженный комплемент повторному замораживанию не подлежит).
Титрование комплемента.
Готовят основное разведение комплемента 1:10 (в случае наличия сухого комплемента, содержимое ампулы растворяют в 10 мл физиологического раствора), из которого по схеме получают последующие его разведения (обычно до 1:30 - 1:40) (таблица 4).
Таблица 4
┌─────────────────┬─────────────────────────────────────────────────────┐
│ Ингредиенты │ Разведения комплемента │
│ ├────────┬────────┬────────┬────────┬────────┬────────┤
│ │ 1:15 │ 1:18 │ 1:20 │ 1:25 │ 1:30 │ и т.д. │
├─────────────────┼────────┼────────┼────────┼────────┼────────┼────────┤
│ Комплемент │ │ │ │ │ │ │
│ 1:10 (мл) │ 1 │ 1 │ 0,5 │ 0,5 │ 0,5 │ │
├─────────────────┼────────┼────────┼────────┼────────┼────────┼────────┤
│ Физиологи- │ │ │ │ │ │ │
│ ческий │ │ │ │ │ │ │
│ раствор (мл) │ 0,5 │ 0,8 │ 0,5 │ 0,75 │ 1,0 │ │
└─────────────────┴────────┴────────┴────────┴────────┴────────┴────────┘
Из приготовленных разведений комплемента переносят по 0,1 мл его в контрольный ряд (без антигена) и опытные ряды (по числу использованных в РСК антигенов) (таблица 5).
Таблица 5
┌─────────────────┬─────────────────────────────────────────────────────┐
│ Ингредиенты │ Разведение комплемента │
├─────────────────┴─────────────────────────────────────────────────────┤
│ Контрольный ряд │
│ (оценка качества комплемента) │
├─────────────────┬──────┬──────┬──────┬──────┬───────┬────────┬────────┤
│ │ 1:10 │ 1:15 │ 1:18 │ 1:20 │ 1:25 │ 1:30 │ и т.д. │
├─────────────────┼──────┼──────┼──────┼──────┼───────┼────────┼────────┤
│Комплемент в │ │ │ │ │ │ │ │
│различных │ │ │ │ │ │ │ │
│разведениях (мл) │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1│ 0,1 │ │
├─────────────────┼──────┼──────┼──────┼──────┼───────┼────────┼────────┤
│Физиологический │ │ │ │ │ │ │ │
│раствор (мл) │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2│ 0,2 │ │
├─────────────────┼──────┼──────┼──────┼──────┼───────┼────────┼────────┤
│Гемолитическая │ │ │ │ │ │ │ │
│ система (мл) │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2│ 0,2 │ │
├─────────────────┼──────┼──────┼──────┼──────┼───────┼────────┼────────┤
│Оценка резуль- │ │ │ │ │ │ │ │
│тата │ - │ - │ - │ - │ - │ + │ │
├─────────────────┴──────┴──────┴──────┴──────┴───────┴────────┴────────┤
│ Опытный ряд │
│ (оценка антикомплементарных свойств антигена) │
├─────────────────┬──────┬──────┬──────┬──────┬───────┬────────┬────────┤
│ Комплемент в │ │ │ │ │ │ │ │
│ различных │ │ │ │ │ │ │ │
│ разведениях │ │ │ │ │ │ │ │
│ (мл) │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1│ 0,1│ 0,1│ 0,1 │ │
├─────────────────┼──────┼──────┼──────┼──────┼───────┼────────┼────────┤
│ Антиген в │ │ │ │ │ │ │ │
│ рабочей дозе │ │ │ │ │ │ │ │
│ (мл) │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1│ 0,1│ 0,1│ 0,1 │ │
├─────────────────┼──────┼──────┼──────┼──────┼───────┼────────┼────────┤
│ Физиологи- │ │ │ │ │ │ │ │
│ ческий │ │ │ │ │ │ │ │
│ раствор (мл) │ 0,1 │ 0,1 │ 0,1│ 0,1│ 0,1│ 0,1 │ │
├─────────────────┼──────┼──────┼──────┼──────┼───────┼────────┼────────┤
│ Гемолитичес- │ │ │ │ │ │ │ │
│ кая система* │ │ │ │ │ │ │ │
│ (мл) │ 0,2 │ 0,2 │ 0,2│ 0,2│ 0,2│ 0,2 │ │
├─────────────────┼──────┼──────┼──────┼──────┼───────┼────────┼────────┤
│ Оценка │ │ │ │ │ │ │ │
│ результатов │ - │ - │ - │ - │ + │ +++ │ │
└─────────────────┴──────┴──────┴──────┴──────┴───────┴────────┴────────┘
* Добавляют на второй день титрования комплемента (после 16 - 18 часов экспозиции при температуре +4°С).
Дозу комплемента с антигеном, дающую полный гемолиз, считают за титр комплемента или "полную единицу", в данном примере она соответствует разведению комплемента 1:20. Раз оттитрованной рабочей дозой комплемента можно пользоваться в течение месяца при работе с этой серией комплемента и эритроцитов.
После 30-минутной экспозиции при температуре +37°С учитывают результаты.
При постановке реакции "холодным" методом (+0°С) рабочая доза комплемента соответствует двум полным единицам в виде удвоенного объема комплемента - 0,2 мл. Например, полный гемолиз в опытном ряду, т.е. в присутствии антигена, отмечен в пробирке при разведении комплемента 1:20, а в контрольном ряду - 1:25. В итоге, рабочая доза комплемента при использовании в реакции данного антигена соответствует разведению 1:20 в объеме 0,2 ил, поскольку, в этих условиях не выявляются антикомплементарные свойства антигена. Например, на 100 пробирок неодолимо приготовить 20 мл разведенного 1:20 комплемента (из расчета 0,2 мл на пробирку), следовательно, нужно взять 1,0 мл цельного комплемента и 19,0 мл физиологического раствора.
В случае, если в реакции используют не 1, а 2 или 3 разного вида антигенов, то и титрование комплемента проводят в присутствии всех видов антигенов, после чего выбирают соответствующие дозы комплемента.
При постановке реакции при +37°С рабочая доза комплемента составит 1 полную единицу, т. е. объем его не 0,2, а 0,1 мл и общий объем РСК в этом случае будет 0,5 мл.
В основном опыте контролируют рабочую дозу комплемента, полную единицу комплемента и ее половину ("холодное" связывание) или полную единицу комплемента и ее половину (связывание при + 37°С). Иными словами, в первом случае: 0,2 мл комплемента в рабочей дозе +0,2 мл физиологического раствора; 0,1 мл комплемента в рабочей дозе +0,3 мл физиологического раствора, и 0,05 мл комплемента в рабочей дозе +0,35 мл физиологического раствора. В 1 и 2-ом контролях должен наблюдаться полный гемолиз, в 3-ем - задержка его на три - два креста. Во 2-м случае (т.е. связывание при +37°) для контроля используют 2 последние дозы.
Постановка основного опыта.
Инактивированные испытуемые сыворотки разводят физиологическим раствором и разливают в пробирки (или лунки полистироловых панелей) по 0,1 мл. К различным разведениям исследуемых сывороток добавляют по 0,1 мл антигена и 0,2 мл комплемента в его рабочей дозе.
Каждый опыт должен сопровождаться следующими контролями:
1) контроль всех испытуемых сывороток (0,1 мл сывороток, в исходном разведении + 0,2 мл комплемента в рабочей дозе + 0,1 мл физиологического раствора);
2) контроль антигена (0,1 мл антигена + 0,2 мл комплемента в рабочей дозе + 0,1 мл физиологического раствора);
3) контроль комплемента (как указано выше);
4) контроль гемолитической системы (0,4 мл физиологического раствора).
Кроме того, необходимо в качестве контроля вводить в опыт заведомо положительную и отрицательную сыворотки с их контролями. Положительную сыворотку разводят до ее титра. После тщательного встряхивания пробирки ставят в холодильник при +0°С на 16 - 20 часов (1-й этап реакции, таблица 6).
Таблица 6