Методы выделения и очистки вирусов.
Выделение вирусов в культурах клеток. При выделении вирусов из различных инфекционных материалов (кровь, моча, слизистые отделяемые, смывы из органов) применяют культуры клеток, обладающих наибольшей чувствительностью к предполагаемому вирусу. Для заражения используют культуры в пробирках с хорошо развитым монослоем клеток. Перед заражением клеток питательную среду удаляют и в каждую пробирку вносят по 0,1–0,2 мл взвеси исследуемого материала, предварительно обработанного антибиотиками для уничтожения бактерий и грибов. После 30-60 мин контакта вируса с монослоем клеток удаляют избыток материала, в культуру вносят поддерживающую среду и пробы оставляют в термостате до выявления признаков размножения вируса.
Выделение вирусов на лабораторных животных. При невозможности выделить и идентифицировать вирус стандартными методами in vitro инфекционный материал вводят чувствительным к возбудителю животным, и после развития типичного инфекционного процесса проводят повторное заражение чувствительных клеточных культур. Наиболее часто используют мышей, кроликов и обезьян; для выделения некоторых вирусов (например, вирусов Коксаки) заражают мышат-сосунков. Т.о., для выделения чистых культур вирусов в лабораторных условиях в настоящее время используются следующие живые объекты (биологические модели): 1) культура клеток (тканей, органов); 2) куриные эмбрионы; 3) лабораторные животные. Методы очистки вируссодержащего материала. Вируссодержащий материал необходимо освободить от взвешенных плотных частиц песка и стекла, от обрывков тканей и клеточных элементов, от бактериальной и грибковой микрофлоры. Существует несколько методов очистки. Они бывают механические, физические, химические и биологические. Механические: 1.Фильтрация. Рабочую суспензию освобождают от сравнительно крупных взвешенных твердых частиц через бактериальные. При этом вируссодержащий материал освобождается от клеточных элементов и бактериальной микрофлоры. 2. Центрифугирование. 10% рабочую суспензию наливают в стерильные центрифужные пробирки и центрифугируют при 6-8 тыс. об/мин- 10-15 минут. При этом осаждаются не только частицы песка, стекла, обрывки клеток, но и бактериальная микрофлора. В надосадочной жидкости останется чистое вещество. Физические: Метод термолизиса. Химический метод очистки используется при работе с известными вирусами, на которые эфир или хлороформ не оказывает губительного действия, т.е. является эфиро и хлороформо устойчивым. Биологический метод очистки. Известно, что многие антибиотики не оказывают губительного действия на вещества, надежно убивают бактериальную микрофлору. С этой целью к рабочей суспензии добавляют пенициллин - для подавления грамм «+» микрофлоры, стрептомицин для подавления грамм ‹- › микрофлоры и нистатин для подавления грибковой микрофлоры в дозе от 500 до 2000 ЕД./мл в зависимости от степени бактериального загрязнения материала, и выдерживать 1 час. Для проверки суспензии на стерильность в отношении бактериальной микрофлоры делают посевы на МПА, МПБ, МППБ среду Сабуро или Чапека. Если в течение 3 суток роста микрофлоры нет, то суспензия считается стерильной и она пригодна к дальнейшей вирусологической работе по культивированию вирусов. Этот метод используется наиболее часто в лабораториях для очистки вируссодержащего материала от бактериальной микрофлоры.
Культуры клеток и их преимущество перед лабораторными животными и куриными эмбрионами.
Для культивирования вирусов используют культуры клеток, куриные эмбрионы и чувствительных лабораторных животных. Культуры клеток. Культуры клеток готовят из тканей животных или человека. Культуры подразделяют на первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые.
Приготовление первичной культуры клеток складывается из нескольких последовательных этапов: измельчения ткани, разъединения клеток путем трипсинизации, отмывания полученной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующим суспендированием клеток в питательной среде, обеспечивающей их рост, например в среде 199 с добавлением телячьей сыворотки крови.