Определение групп крови перекрёстным способом
Способ наиболее часто используют в серологических лабораториях. Суть метода состоит в определении наличия или отсутствия в исследуемой крови групповых антигенов А и В с помощью стандартных изогемагглютинирующих сывороток, а также групповых антител α и β с помощью стандартных эритроцитов. Реакцию со стандартными сыворотками проводят описанным выше способом.
Реакцию со стандартными эритроцитами проводят следующим образом.
Необходимое оснащение
Оснащение для реакции со стандартными эритроцитами отличается тем, что для её проведения необходимы стандартные эритроциты трёх групп крови: 0(I), А(II), B(III). Стандартные эритроциты приготавливают из крови доноров с заранее известной группой крови, хранят при 4-8 ?С. Срок годности 2-3 дня.
Методика проведения реакции
1. Кровь для исследования берут из вены в сухую пробирку, центрифугируют или оставляют в покое на 20-30 мин для получения сыворотки.
2. На маркированную тарелку пипеткой наносят три больших капли (0,1 мл) сыворотки исследуемой крови из пробирки, а рядом с ними - по одной маленькой капле (0,01 мл) стандартных эритроцитов групп.
3. Дальнейшие мероприятия проводят аналогично методу с использованием стандартных изогемагглютинирующих сывороток: соответствующие капли смешивают стеклянными палочками, планшет покачивают, наблюдают в течение 5 мин, в капли с агглютинацией
Таблица 6-3.Оценка результатов определения группы крови перекрёстным способом
добавляют изотонический раствор хлорида натрия, после чего оценивают результат.
Трактовка результатов
Оценивают данные, полученные при обеих реакциях (со стандартными изогемагглютинирующими сыворотками и стандартными эритроцитами - табл. 6-3).
Особенность трактовки результатов реакции со стандартными эритроцитами - эритроциты группы 0(I) считают контрольными (в них нет антигенов, что делает принципиально невозможной специфическую реакцию агглютинации с любой сывороткой).
Результат перекрёстного способа считают достоверным, только если при оценке результатов реакции со стандартными изогемагглютинирующими сыворотками и со стандартными эритроцитами ответы о группе исследуемой крови совпадают. Если этого не происходит, обе реакции следует переделать.
Определение групп крови моноклональными антителами
Необходимое оснащение
Для определения группы крови используют моноклональные антитела, для получения которых применяют гибридомную биотехнологию.
Гибридома - клеточный гибрид, образованный путём слияния клетки опухоли костного мозга (миеломы) с иммунным лимфоцитом, синтезирующим специфические моноклональные антитела. Гибридома приобретает свойства обоих «родителей»: способность к неограниченному росту, характерную для опухолевой клетки, и возможность синтезировать антитела, присущую иммунному лимфоциту.
Таблица 6-4.Схема оценки результатов определения групп крови с помощью моноклональных антител (цоликлоны анти-А и анти-В)
Разработаны стандартные реагенты - моноклональные антитела: цоликлоны анти-А и анти-В, применяемые для определения агглютиногенов эритроцитов. Цоликлоны используют в виде лиофилизированного порошка красного (анти-А) или синего (анти-В) цвета, порошок разводят изотоническим раствором натрия хлорида непосредственно перед исследованием.
Техника проведения реакции
Цоликлоны анти-А и анти-В наносят на белый планшет по одной большой капле (0,1 мл) под соответствующими надписями: анти-А и анти-В. Рядом с ними наносят по одной маленькой капле (0,01 мл) исследуемой крови. После перемешивания составных частей за реакцией агглютинации наблюдают в течение 2-3 мин.
Трактовка результатов
Методика определения группы крови с помощью цоликлонов позволяет отказаться от стандартных изогемагглютинирующих сывороток, получаемых из донорской крови.
Возможные ошибки
Определение групповой принадлежности с помощью реакции агглютинации может сопровождаться ошибками, ведущими к неверной трактовке результатов. Все ошибки можно разделить на три группы:
• низкое качество реагентов;
• технические ошибки;
• особенности исследуемой крови.
Низкое качество реагентов
Стандартные изогемагглютинирующие сыворотки и стандартные эритроциты могут иметь низкие агглютинабельные свойства, что приводит к неверному толкованию результатов реакции. Во избежание подобных ошибок нужно следить за сроком годности, условиями хранения и внешним видом реагента (прозрачность сыворотки, отсутствие плёнок, хлопьев, запаха гниения и пр.).
Технические ошибки
Ошибки технического характера связаны с несоблюдением или недостаточно точным выполнением всех правил проведения реакции.
Несоблюдение внешних условий
Плохая освещённость мешает обнаружить агглютинацию или её отсутствие.
Повышение температуры выше 25 ?С резко замедляет реакцию.
При низкой температуре (ниже 15 ?С) может произойти неспецифическая агглютинация, независимо от состава агглютининов и агглютиногенов - так называемая холодовая панагглютинация (агглютинация возникает при реакциях с сыворотками всех групп крови). Это происходит из-за наличия в сыворотке особого холодового агглютинина, способного давать реакцию агглютинации только при низких температурах.
Неправильное проведение самой реакции
Нарушение расположения сывороток, соотношения сыворотки и крови, слияние соседних капель создают возможность неправильной интерпретации полученных результатов.
Ранняя оценка результатов также может привести к ошибке, особенно при наличии слабого антигена А2, дающего позднюю агглютинацию.
Недобавление физиологического раствора. Несоблюдение этого простого правила (в капли, где произошла агглютинация, следует добавить изотонический раствор хлорида натрия) может привести к тому, что за специфическую агглютинацию принимают ложную (псевдоагглютинацию). Под термином «псевдоагглютинация» подразумевают способность эритроцитов склеиваться в «монетные столбики», или «кучки», с сохранением мембран, независимо от их агглютинабельных свойств. Границы между форменными элементами хорошо
видны под микроскопом, в отличие от истинной агглютинации, при которой происходит разрушение мембран эритроцитов. Добавление 1-2 капель изотонического раствора хлорида натрия позволяет дифференцировать истинную агглютинацию от ложной. Псевдоагглютинация расходится довольно быстро, в то время как истинная агглютинация сохраняется прежней или становится более выраженной.