Определение группы крови стандартными сыворотками капельным способом
Самым распространенным способом остается определение на плоскости. По этому способу можно производить реакцию агглютинации на любой плоскости - на простом стекле, фарфоровой или костяной пластинке, тарелке и т. д. Этот способ называется также капельным по характеру производства реакции в капле сыворотки. Для лучшего определения результатов реакции необходим белый фон, поэтому под стекло надо подкладывать белую бумагу. Белые фарфоровые пластинки и тарелки сразу дают нужный фон. Большие мелкие тарелки являются наиболее подходящей и доступной плоскостью для производства реакции агглютинации по капельному способу. Тарелки надо отбирать без рисунков, с хорошей ровной поверхностью внутреннего круга. Шероховатые, с волнистыми неровностями и покатостями тарелки не годятся.
Для производства реакции по капельному способу нужны следующие предметы:
Реактивы: а) стандартные сыворотки групп 0, А и В, б) 0,85% раствор NaCl.
Материалы: а) предметные стекла или тарелки, б) пипетки для сывороток и солевого раствора, в) пипетки для взятия крови, г) стеклянные палочки.
Кроме того, для взятия крови нужны: а) игла для взятия крови или заменяющий ее инструмент, б) эфир или денатурированный спирт, в) вата.
Прежде считалось, что для определения группы крови достаточно двух сывороток - А и В. Теоретически это верно, но практически в целях контроля оказалось необходимым ввести еще одну сыворотку группы 0, так как возможность панагглютинации или, наоборот, слишком слабый титр эритроцитов иногда может дать повод к ошибкам с сыворотками А и В, и требуется контроль, который выполняется сывороткой 0.
Рекомендуется при определении группы крови пользоваться стандартными сыворотками группы 0, А и В двух различных серий, причем результаты реакции с одной серией и результаты с другой должны быть одинаковы.
Мы полагаем, что по вскрытии ампулы всякая сыворотка должна быть проверена в своей групповой принадлежности. Без этого ни одна сыворотка не может быть допущена к непосредственному употреблению. Эта проверка необходима не только во избежание ошибок, могущих произойти при разливе, но и потому, что титр сыворотки может настолько снизиться, что сделает ее негодной к употреблению. Проверку производят по стандартным эритроцитам или по цельной крови лиц с известной группой крови. Эти лица всегда должны быть в распоряжении лаборатории.
Пипетки для сыворотки и солевого раствора должны быть типа глазных, выпускающие каплю объемом 50-60 мм3. Каждая сыворотка имеет свою пипетку и смешение их не должно допускаться. Пипетки для взятия крови - типа пастеровских, с более узким капилляром, выпускающие каплю 5-6 мм3. Стеклянные палочки имеют длину 12-15 см, концы их вытянуты конусом и слегка закруглены на огне.
На стол ставится деревянная колодка или штатив с углублениями, в которые вкладываются ампулы или пробирки с сыворотками 0 (слева), А (в середине) и В (справа). Вместо штатива сосуды с сыворотками можно ставить в отдельные стеклянные стаканчики. В каждый сосуд с сывороткой опускается чистая сухая пипетка, которая остается там до конца исследования или истощения запаса сыворотки. Тут же устанавливают флакон с солевым раствором, денатурированный спирт, вата, в отдельном стакане - пипетки для крови и палочки. Перед исследующим на стол ставят тарелку или кладут предметные стекла, под которыми находится белая бумага.
Для производства реакции кровь берут обычным способом посредством легкого укола пальца или ушной мочки иглой для взятия крови. Из выступившей капли малой пипеткой или краем предметного стекла переносят три капли крови, величиной с булавочную головку (4-6 мм3), на поверхность стекла или тарелки, располагая эти капли подряд, на расстоянии 2-3 см одна от другой. Вслед за этим около или поверх левой капли выпускают на поверхность большую каплю (50-60 мм3) сыворотки 0, около или поверх средней капли крови - каплю сыворотки А и около или поверх правой - каплю сыворотки В. Сверху каждой капли следует обозначить соответствующую группу сыворотки. Каждую сывороточную пипетку после нанесения капли немедленно опускают в свой флакон.
Затем перемешивают кровь с сывороткой (в том же порядке) стеклянной палочкой или краем предметного стекла 10-15 секунд, пока смесь не примет равномерно розовый цвет. Для каждой капли надо брать чистую палочку или бывшую в употреблении, предварительно смочив ее в воде и высушив. Отмечают время начала реакции. После смешивания тарелку (или стекло) покачивают, но делают это осторожно и слегка, ни в коем случае не толчками.
Агглютинация проявляется обычно в первые секунды после смешения. Появляются мелкие кучки, которые при покачивании склеиваются в более крупные агрегаты, иногда в одну большую кучу в середине капли.
Независимо от результатов реакции через 2 минуты от начала смешения крови с сывороткой к каждой капле смеси прибавляют по большой капле (50-60 мм3) физиологического раствора хлористого натрия и покачивают при соблюдении приведенных выше правил. При покачивании надо наблюдать, чтобы смесь не растекалась по поверхности, а оставалась на своем месте.
Особенно нужно следить, чтобы две соседних смеси не приходили в соприкосновение. В противном случае реакцию приходится начинать сначала.
При положительной реакции еще до прибавления солевого раствора эритроциты склеиваются сначала в мелкие, а затем в более крупные кучки и хлопья диаметром 1 мм и более, по большей части неправильной формы. Сыворотка при этом совсем обесцвечивается. От прибавления солевого раствора кучки не должны исчезать. Исчезновение кучек в этом случае указывает на панагглютинацию, а не на истинную агглютинацию.
При отрицательной реакции смесь остается мутной и окрашенной в розовый цвет, без признаков скучивания. Иногда, вследствие слишком энергичного покачивания, вызывающего волнообразные колебания смеси, эритроциты теряют равномерность в распределении и образуют мраморный узор, но это явление исчезает от прибавления солевого раствора или от, помешивания.
При работе с тремя сыворотками возможны восемь комбинаций положительных и отрицательных реакций, но из них только четыре истинных, определяющих группу.
При наличии одной из этих комбинаций реакцию надо повторить с новыми сыворотками. При производстве реакции на стекле надо предварительно надписать около каждой капли группу сыворотки - 0, А, В. Если стекло случайно и незаметно будет перевернуто, что нередко случается в руках, то надписи предохраняют от ошибок и недоразумений. Кроме того, на стекле пишут фамилию испытуемого.
Результаты реакции немедленно по выяснении заносятся в соответствующий документ - журнал, карточку, список, историю болезни и т. д. Запись группы отдельного лица в его документе сопровождается обозначением времени и места определения и скрепляется подписью врача, определявшего группу.