Куриный эмбрион развивается 21 день. Заражение вирусом производится с 5-го по 12-й день.
Топография куриного эмбриона (продольный разрез, 12 дней)
1. Скорлупа
2. Подскорлупная оболочка
3. Воздушная камера
4. Аллантоисная полость
5. Желточный мешок
6. Альбуминный мешок
7. ХАО – хорион-аллантоисная оболочка
8. Амниотическая полость
9. Эмбрион
10. Канатик (соединение желточного мешка с пуповиной)
Для заражения выбирают здоровые эмбрионы. Для этого проводят овоскопию. На скорлупе делают пометки карандашом – границы воздушной камеры и местоположение зародыша.
I. Заражение в аллантоисную полость.
Все операции проводят асептично с горящей газовой горелкой. Место введения обрабатывают 2% йодированным спиртом, вводят 0,1-0,2 мл жидкости. Отверстие закрывают каплей расплавленного парафина. На скорлупе пишут:
- название вируса
- дату
- фамилию
II. Заражение через искусственную воздушную камеру на ХАО.
1. Делается отверстие в области воздушной камеры.
2. Делается окошко «А»
3. Отсасывается воздух из воздушной камеры.
4. В окошко «А» капается вирус содержащая жидкость. Отверстие заклеивается лейкопластырем.
5. На скорлупе пишется название вируса, дата, фамилия.
Индикация вируса в курином эмбрионе.
1. Гибель куриного эмбриона в характерные для данного вируса сроки. Гибель эмбрионов в первые сутки не специфична. Эмбрионы погибшие в более поздние сроки переносятся в холодильник (+ 4С). Все эмбрионы извлекают из термостата в момент максимального накопления вируса. Срок для каждого вируса – справочные данные.
2. Вскрытие эмбриона и анализ патологоанатомических изменений.
- Отечная ХАО и белые узелки некроза (оспины).
- Мутность или изменение цвета аллантоисной и амниотической жидкостей. Красноватый цвет жидкостей – результат гемолиза.
- Изменения зародыша: карликовость, кровоизлияния, мумификация.
- Органы зародыша – некроз, кровоизлияния.
3.Наличие гемаглютинации при проведении капельной реакции ГА. (аллантоисная жидкость + 5% р-р эритроцитов кур)
Использование культуры клеток.
Культура клеток это клетки многоклеточного организма живущие и размножающиеся в искусственных условиях (in vitro).
Типы культур клеток.
| Тип клеток Свойства | Частично Трипсинизированные | Перевиваемые | Диплоидные |
| Происхождение | Из органов | Из первичных | Из первичных |
| Продолжительность жизни | 3-5 пассажей | Неограниченное количество пассажей | Около 50 пассажей: - гибель - перевивание |
| Кариотип | 2n | Xn | 2n |
| Способность образовывать опухоли | - | + | - |
Этапы получения первичной культуры.
1. Берут ткань молодого животного (лучше всего эмбриона).
2. Кусочки ткани отмывают от эритроцитов в растворе Хенкса.
3. Кусочки ткани заливают теплым раствором трипсина.
4. Раствор ставят на магнитную мешалку, в колбу кладут магнит.
5. Проводят дробную трипсинизацию.
6. Раствор трипсина сливают в центрифужные пробирки. В растворе находятся отдельные клетки.
7. Центрифугация в течении 10 минут – 1000 об/мин, затем трипсин сливают.
8. Клетки помещают в питательную среду:
- среда 199
- среда Игла
- среда гидролизатлактальбумина.
9. Проводят подсчет клеток в камере Горяева
10. Клетки разводят питательной средой до посевной концентрации от 500 000 до 1 000 000 клеток на мл.
11. Добавляют 10% сыворотки КРС.
12. Разливают в пробирки, матрасы или роллерные колбы и культивируют.
13. После формирования монослоя (3-5 день) молодую культуру клеток заражают вирусом.
Лучше всего работать с диплоидными культурами клеток, так как как они свободны от контаменантов (бактерии, грибы, микоплазмы)
Используемые растворы.
1. раствор Хенкса (дистилированная вода, соли, антибиотики)
2. раствор Эрла (имеет несколько другой солевой состав) Эти растворы используют как солевую базу для отмывания клеток.
3. Раствор трипсина (0,25%) используют для разделения клеток, для снятия их со стекла.
4. Раствор Версена используют для снятия клеток со стекла при пересеве.
Используемые среды.
1. Среда 199 – 20 АМК, более 17 гормонов, всего 69 компонентов.
2. Среда Игла (Eagle)
3. Среда ГЛА (гидролизатлактоальбумина.
Заражение культуры клеток.
1. С выросшего монослоя сливают ростовую питательную среду.
2. Отмывают клетки от ростовой питательной среды р-ром Хенкса или Эрла.
3. Заливают вирус содержащий материал 0,1-0,2 мл.
4. Помещают в термостат (30-60 минут)
5. Вирус содержащий материал удаляют (не обязательно) и заливают поддерживающую среду.
6. Зараженную культуру ставят в термостат (37 С) и ежедневно контролируют просматривая под микроскопом.
Методу обнаружения вируса в культуре клеток.
ЦПД – цитопатическое действие.
1. Гибель клетки с округлением. Округленная клетка слабо прикрепляется к субстрату и выпадает из монослоя, который приобретает вид кружева.
2. Гибель клетки с фрагментацией.
3. Образование симпластов.
Адсорбция эритроцитов на поверхности зараженных клеток.
При проникновении вируса через клеточную оболочку в ней задерживаются вирусные белки и оболочка приобретает свойства белков вируса, а следовательно способность к ГАд.
Серологические реакции.
РИФ – реакция иммунофлюорисценции.
АГ + АТ меченные флюорохромом. Дают контакт 30 минут при 37 С, затем производят тщательный отмыв в физрастворе. Метод обнаружения – флюоресцентное свечение под микроскопом.
ИФА – иммуно-ферментный анализ.
АГ + АТ с ферментом. Контакт, отмыв, затем добавляют субстрат, который при контакте с АТ-ферментным комплексом дает цветную реакцию.
РСК – реакция связывания комплемента.
АГ + АТ + комплемент. Контакт. Затем добавляют гем-систему (гемолизин + эритроциты барана). Контакт. Если гемолиза не происходит, значит АГ и АТ связали комплемент. Задержка гемолиза – реакция положительная. Если произошел гемолиз, значит комплемент связан гем-системой – реакция отрицательная.
4. РДП - реакция диффузной преципитиции.
АГ + АТ (диффузия в агаровом геле). Метод обнаружения – образование контура преципитации.
РНГА – реакция непрямой гемаглютинации.
Эритроциты нагружают АГ и при образовании комплекса АГ-АТ происходит агглютинация эритроцитов.
РТГА – реакция торможения гамаглютинации
РТГАд – реакция торможения гемадсорбции
РН – реакция нейтрализации.
Вирус + АТ. Контакт. Ввод в чувствительную к вирусу систему. Метод обнаружения – нейтрализация инфекционной активности вируса.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР).
ПЦР является наиболее чувствительным методом. Реакция обнаруживает вирусные НК. Реакция открыта в 1985 году в США.
Сутью метода является амплификация, т.е. увеличение числа копий строго определенных фрагментов молекул ДНК in vitro. ПЦР основана на амплификации ДНК при помощи ДНК-полимеразы, которая осуществляет синтез взаимо-комплементарных цепей ДНК начиная с 2-х праймеров (затравок)
Primer – фрагмент ДНК из 20-30 нуклеотидов. Синтезированный искусственно. Праймеры комплементарны противоположным цепям ДНК. Обычно при ПЦР ставят от 25 до 40 циклов в зависимости от возбудителя. Каждый цикл состоит из трех этапов.
1. Денатурация. 92-95 градусов С, 20-60 секунд. Происходит разрыв водородных связей цепей ДНК.
2. Отжиг – присоединение праймеров. 50-60 градусов С, 40-60 секунд. Происходит забрасывание праймеров, нуклеотидов и ДНК-полимеразы.
3. Элонгация – достраивание цепей ДНК. 68-72 градуса С, 40-60 секунд. Число цепочек ДНК удваивается. Образовавшиеся в первом цикле цепочки ДНК служат матрицами для последующих циклов и т.д. Таким образом в каждом цикле идет удвоение числа копий амплифицируемого участка, что позволяет за 25-40 циклов наработать 225-240 участков ДНК, что позволяет обнаружить их методом электрофореза.
В ПЦР используют праймеры из консервативных участков ДНК вируса, которые имеют уникальную последовательность для каждого возбудителя.
Методика постановки.
Из исследуемого материала выделяют НК, которую помещают в чистую пробирку и добавляют амплифицирующую смесь, которая состоит из:
- Буфера
- ДНК-полимеразы
- Раствора 2-х видов праимеров
- 4-х видов нуклеотидов
- Магний-хлорного катализатора
- Крезолового красного для визуальной оценки
- Доливают деионизированной воды.
- Сверху капают минеральное масло.
Пробирки помещают в програмируемый термостат-амплификатор и проводят амплификацию в автоматическом режиме по заданной программе для соответствующего вида возбудителя (2-3 часа). Одновременно ставят положительный и отрицательный контроль.
Регистрация результатов – детекция амплификонов. Проводят методом электрофореза в 1-2% агаровом геле в присутствии бромистого этидия, который соединяется с фрагментами ДНК и высвечивается в виде полосок при УФО (трансилюминатор).
Противовирусный иммунитет.
В понятие противовирусного иммунитета входят три категории: видовая резистентность, неспецифические клеточные и обще физиологические реакции и специфический иммунитет.