Метод иммуноферментного анализа

Для определения токсина применяется иммуноферментный анализ ( ИФА) в твердофазном варианте с использованием моноклональных антитоксических противодифтерийных антител ( МкАТ), полученных к СООН- концевому участку В-фрагмента дифтерийного токсина, ответственного за биологическое связывание с клетками макроорганизма, и иммобилизованным на полистироле. Используются также поликлональные антитоксические противодифтерийные антитела ( ПкАТ) , меченные ферментом- пероксидазой хрена.

Сорбированные на поверхности полистирола планшетов МкАТ связывают находящиеся в исследуемых пробах молекулы дифтерийного токсина и не связывают никаких других продуктов микробного или иного происхождения. При наличии в анализируемых пробах токсина образовавшийся комплекс моноклональные антитела –дифтерийный токсин-поликлональный конъюгат с пероксидазой проявляется индикаторной субстратной сесью перекиси водорода с 5-аминосалициловой кислотой.

Учет реакции производят визуально или инструментально по изменению цвета субстратной смеси. Высокая чувствительность и специфичность метода позволяет выявить токсин в концентрации 4-8 нг/мл или 0,002 Lf/мл анатоксина.

Значительным преимуществом ИФА является возможность индикации токсина непосредственно в жидкой питптельной среде, минуя этап выделения чистой культуры.

-14-

Реакция ПАССИВНОЙ или НЕПРЯМОЙ АГГЛЮТИНАЦИИ

Реакция пассивной или непрямой агглютинации РПГА или РНГА- двух-компонентная реакция, предполагает исползование диагностикума эритроцитарного дифтерийного антительного, действующим началом которого являются связанные с эритроцитами очищенные специфической сорбцией поликлональные антитоксические противодифтерийные антитела, вступающие во взаимодействие лишь с дифтерийным токсином – анатоксином.

Чувствительность практически не уступает чувствительности ИФА.

По чувствительности , специфичности, времени проведения анализа имеют преимущество перед РНАт и реакцией преципитации в агаре.

ИФА и РПГА или РНГА позволяют выдать ответ о наличии токсина в исследумом материале на 1-3 суток ранее традиционных методов. Следовательно, ИФА и РПГА или РНГА могут быть применены для ускоренного выявления токсина в материале от больных дифтерией, носителей токсигенных коринебактерий дифтерии; от лиц, обследуемых с профилактической целью или по эпидемическим показаниям, а также – в культурах, выделенных на разных этапах бактериологического исследования. Эти методы могут быть использованы в бактериологических лабораториях СЭС, больниц, клиник, научно-исследовательских институтов, предприятий по производству бактериальных препаратов, в биотехнологии.

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ПРИ ДИФТЕРИЙНОЙ ИНФЕКЦИИ

Серологический контроль за дифтерийной инфекцией и столбняком осуществляется параллельно.

Для определения в сыворотках крови специфических антител используют реакцию пассивной( непрямой) гемоагглютинации ( РПГА, РНГА) с антигенными : дифтерийным и столбнячным диагностикумами. Результаты выражают в показателях активности антитоксина ( МЕ/мл). При использовании иммунореагентов НИИ эпидемиологии, микробиологии и инфекционных болезней МЗ РК, титр РПГА с дифтерийным

0,2 А

диагностикумом переводят в активность антитоксина по формуле Хд = -------- , со

0,08 А

столбнячным по формуле Х = --------- , где А- максимальное разведение испытуемой

сыворотки с положительным результатом, В - максимальное разведение контрольной

сыворотки с положительным результатом.

В условиях дефицита средств широкомасштабные серологические исследования проводить нецелесообразно. Для проведения серологических исследований предварительно определется цель, методика, территория проведения иммунологического контроля. По результатам работы принимаются конкретные меры. Иммунореагенты для такого контроля производит НИИ эпидемиологии, микробиологии и инфекционных болезней МЗ РК.

-15-

МЕТОДЫ ЭКСТРЕННОЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ДИФТЕРИИ

Такие методы необходимы для своевременного осуществления лечебных и противоэпидемических мероприятий.

Метод по определению антитоксина; Принцип метода основан на том, что при попадании в организм человека токсигенного штамма дифтерийных бактерий процесс может развиваться в 2-х направлениях. Если у человека уровень дифтерийного антитоксина высок, заболевание ( клинически выраженная форма дифтерийной инфекции), как правило, не развивается, дифтерийная инфекция протекает в форме здорового бактерионосительства. Наоборот, если активность дифтерийного антитоксина не обеспечивает эффективную нейтрализацию токсина, развивается клинически выраженная форма дифтерийной инфекции. Этот диагностический подход может быть использован только при раннем взятии крови для исследования ( оптимально – в первые три дня болезни). Соблюдение этого условия при обнаружении в сыворотке крови дифтерийного антитоксина в минимальном защитном или более высоком уровне позволяет расценить наличие антитоксина как результат прошлой иммунизации или инфекции в прошлом, а не заболевания дифтерией в настоящее время. Обусловленность наличия дифтерийного антитоксина прошлой вакцинацией дополнительно подтверждается при параллельном обнаружении столбнячного антитоксина. Данный диагностический метод рекомендуется при обследовании больных ангинами с подозрением на дифтерию.

Выполнение анализа: Кровь для анализа берут однократно. Анализ проводят с использованием диагностикумов эритроцитарных дифтерийного и столбнячного антигенных жидких, содержащих необходимые ингредиенты, и микротитратора Такачи ( или планшетов для иммунологических реакций однократного применения), пипеточного дозатора, пипеток, водяной бани и центрифуги. Анализ обходится дешевле, а его результат получают раньше результата бактериологического исследования.

Проведение РПГА : Реакцию осуществляют как при иммунологическом контроле дифтерийной инфекции в течение одного дня.

Интерпретация анализов: при отсутствии в пробе дифтерийного антитоксина ( активность ниже 0,03 МЕ/мл ) вероятность клинически выраженной формы дифтерийной инфекции очень высока. Обнаружение дифтерийного антитоксина в сыворотке крови делает диагноз дифтерии сомнительным тем в большей мере, чем выше выявленная активность дифтерийного антитоксина.

Соотношение вероятности дифтерии и сочетания ангины с носительством токсигенных дифтерийных бактерий

Активность ( МЕ/мл ) дифтерийного антитоксина	Соотношение
Меньше 0,03 0,03 -0,5 больше 0,5	12,3 : 1 1 :2,5 1 :5,7

- 16-

Метод по определению антигенсвязывающих лимфоцитов ( АСЛ) :

Принцип : Этот диагностический подход основан на том, что не позже, чем через 3 суток после контакта с антигеном в крови практически всех людей обнаруживаются лимфоциты, специфически связывающие антиген. Такое определение проводят при исследовании комплекта иммунореагентов для экстренной специфической диагностики дифтерии. Комплект иммунореагентов для экстренной специфической диагностики дифтерии выпускает НИИ эпидемиологии, микробиологии и инфекционных болезней МЗ РК ( 480002, Алматы, ул. М, Макатаева, 34).

Состав комплекта и необходимое оснащение : Комплект сотоит из 1 флакона ( 6,6 мл ) диагностикума ( Д) и 1 флакона ( 6,6 мл) контрольного диагностикума ( Дк). Д представляет собой взвесь фиксированных эритроцитов кур, сенсибилизированных дифтерийным анатоксином ( Ед), и фиксированных эритроцитов быка, сенсибилизированных столбнячным анатоксином ( Ес), Дк представляет собой взвесь фиксированных эритроцитов кур и быка в тех же концентрациях, в которых они входят в Д, но не сенсибилизированных анатоксинами. Дк применяют для определения уровня спонтанного розеткообразования.

При проведении анализа, кроме иммунореагентов, используют следующие реактивы, препараты и оборудование:

- Гепарин, Московский эндокринный завод;

- Фиколл -400, Pharmacia Fine Chemical ( Швеция) или Serva ( ФРГ), верографин, Spofa ( Чехия), вместо верографина для приготовления градиента можно применить урографин, уротраст, триамбраст Spofa ( Чехия) и тразограф ( Испания).

Фиколл-верографиновый градиент готовят смешением 12 частей 9 % раствора фикола 400, приготовленного на дистиллированной воде, и 5 частей 33,9 % раствора верографина ( или заменяющего его препарата), приготовленного на дистиллированной воде. Правильность приготовления градиента контролируют ареометром:

- 3 % раствор уксусной кислоты;

- 3 % расвор глутарового альдегида,

-0,1% раствор метиленового синего;

-- смесь Никифорова,

- 96 этиловый спирт;

- ареометр, диапозон измеряемых им плотностей должен включать 1,077 – 1, 079 г/См ;

- дозаторы пипеточные на 0,02 и 0,1 мл;

- камера Горяева;

- микроскоп бинокулярный;

- центрифуга с горизонтальным ротором;

- термрстат на 37 с;

- холодильник на 4 С;

- счетчик клеток ( для регистрации лимфоцитов), например, счетчик лабораторный СЛ-I ТУ 64- I - 3031-78, москва;

- пробирки, пипетки градуированные и пастеровские, предметные и покровные стекла, резиновая груша.

Фиколл- 400 может быть приобретен через фирмы, поставляющие в Республику Казахстан препараты и химреактивы, верографин и заменяющие гео препараты – через аптечную сеть.

Получение крови и выделение лимфоцитов, реакцию смешанного розеткообразования, учет результатов проводят в соответствии с Инструкцией по применению

- 17 -

иммунореагентов для экстренной специфической диагностики дифтерии, прилагаемой к комплекту иммунореагентов для экстренной специфической диагностики дифтерии.

Диагностическую оценку результатов анализа проводят на основе статистического определения достоверной разности содержания выявленных розеткообразующих лимфоцитов в мазках с опытным ( Д) и контрольным ( Дк) диагностикумами. Антигенсвязывающие лимфоциты данной специфичности выявлены, если такая разность статистически достоверна.

При клинической интерпретации результатов определенияантигенсвязывающих лимфоцитов исходят из следующего:

Антигенсвязывающие лимфоциты данной специфичности обнаруживаются в результате недавнего контакта с соответствующим антигеном. Таким антигеном может явиться не только токсин дифтерийных бактерий или столбнячных бацилл, но и дифтерийный или столбнячный анатоксин ( компоненты вакцин). Поэтому при обнаружении антигенсвязывающих лимфоцитов дифтерийной специфичности необходимо дифференцировать возможность заболевания и поствакцинальную иммунную реакцию. Критерии такой дифференсации:

· вакцинальный анамнез: если обследуемый был вакцинирован за 2-3 недели до обследования, выявление антигенсвязывающие лимфоцитов дифтерийной специфичности может расцениваться как результат вакцинальной иммунной реакции:

· поскольку дифтерийная моновакцина практически не используется, при вакцинальной реакции на АКДС, АДС и АДС-М одновременное обнаружение АСЛ дифтерийной и столбнячной специфичности даже при отсутствии анамнестических данных о недавней вакцинации расценивается, как результат недавней вакцинации.

Антигенсвязывающие лимфоциты дифтерийной специфичности могут быть выявлены не только у больного дифтерией, но и у носителя токсигенных дифтерийных бактерий. Поэтому при положительном результате обнаружения АСЛ дифтерийной специфичности необходимо дифференцировать дифтерию и носительство токсигенных дифтерийных бактерий у обследуемого с другим заболеванием ( чаще всего- ангины).

Критерии такой дифференсации:

-клинические, их надежность ограничена,

- серологический, если у обследованного пациента в начале заболевания выявлен защитный уровень дифтерийного антитоксина, вероятность клинически выраженной формы дифтерийной инфекции тем меньше, чем выше активность дифтерийного антитоксина.

Антигенсвязывающие лимфоциты дифтерийной специфичности обнаруживаются в течение всего периода заболевания. Поэтому метод может быть использован не только для ранней диагностикидифтерии. Введение специфической дифтерийной ( лечебной) сыворотки не мешает последующему обнаружению АСЛ.

Метод определения антигенсвязывающих лимфоцитов может быть при необходимости использован для обследования контактных в очагах дифтерии с целью возможно более раннего выявления больных и носителей токсигенных дифтерийных бактерий.

Зав. лабораторией

иммунодиагностики КИЭМИБ Б. В. Каральник

Протокол №

Семинарского занятия в от 01 .03.2007 г. в ГККП « Каргалинская городская больница»

Тема: ООИ. (Карантинные инфекции) Средства и методы защиты медперсонала. Правила забора материала от больных с ООИ. Семинарское занятие проводят врач-инфекционист А.Ж.Мурзагалиева и врач Актюбинской ПЧС

Семинар заслушали: