Крови реципиента и донора
Пробы на индивидуальную совместимость крови реципиента и донора выполняются с сывороткой крови больного, которую получают путем центрифугирования или отстоя крови в пробирке. Сыворотка для выполнения проб на совместимость годна при хранении в холодильнике в течение 2-3-х суток. Пробы на совместимость по группам крови АВО и на резус-совместимость проводятся последовательно и обе пробы обязательны для выполнения. Также обязательно проведение обеих проб при переливании каждой следующей дозы крови или ее компонентов.
1. Порядок получения сыворотки больного и крови донора.
Для получения сыворотки у больного берут 4-5 мл крови без стабилизатора в пробирку и, после определения группы крови, на пробирку наклеивается групповая марка, на которой должны быть указаны номер медицинской карты, фамилия и инициалы больного, дата. При этом врач должен лично убедиться в том, что надписи на пробирке сделаны правильно и относятся к тому больному, у которого взята эта кровь. Запрещается взятие образцов крови у 2-х или более больных одновременно.
Через 3-5 минут пробирку с кровью следует сильно встряхнуть для отделения сгустка от стенок пробирки или обвести его сухой стеклянной палочкой. После ретракции сгустка от него отделяется сыворотка, которая и служит для выполнения пробы на совместимость (если необходимо ускорить отделение сыворотки, пробирку с кровью центрифугируют около 5 минут при 2000-3000 об/мин).
Кровь донора получают из контейнера (бутылки), который подготовлен для переливания. Для этого кровь выпускают через иглу устройства для переливания крови (или из отрезка трубки контейнера) в небольшом количестве (5-10 капель) в пробирку или на пластинку, на которой будет производиться проба. На пробирке (пластинке) надписывается фамилия и инициалы донора, группа его крови и номер контейнера (бутылки). При этом врач должен лично убедиться в том, что на пробирке (пластинке) правильно указаны все сведения о доноре, имеющиеся на контейнере (бутылке), из которого получена эта кровь. Если больному переливается кровь из нескольких контейнеров (бутылок), пробы на совместимость должны быть выполнены с кровью из каждого контейнера (бутылки), даже если на них обозначено, что кровь получена от одного и того же донора.
Если выявлена несовместимость сыворотки реципиента с эритроцитами донорской крови, необходимо исключить технические ошибки: перепутывание образцов крови, перепутывание отобранных доз донорской крови. Пробы на совместимость следует повторить с эритроцитами из той же дозы крови и из дополнительно отобранной. Параллельно проводится аутотест с собственными эритроцитами пациента. В случае подтверждения несовместимости сыворотки реципиента с донорскими эритроцитами, в частности, у больных с отягощенным трансфузионным или акушерским анамнезом следует провести универсальную пробу на индивидуальную совместимость крови донора и реципиента. При выявлении антител (универсальная проба положительна) пробирка с кровью больного должна быть направлена в учреждение службы крови для индивидуального подбора донорской крови.
Перед переливанием крови или эритроцитарной массы новорожденному необходимо определить группу крови матери и ребенка. Затем эритроциты ребенка исследуют в прямой пробе Кумбса и, если она отрицательна, проводят пробу на совместимость эритроцитов донора и сыворотки ребенка. При совпадении групповой принадлежности у матери и ребенка в пробе на совместимость может быть использована сыворотка матери.
Прямая проба Кумбса (прямой антиглобулиновый тест) применяется для выявления в крови ребенка антител, которые он мог получить от матери (до 4-х-месячного возраста антитела у детей не вырабатываются даже после многократных трансфузий).
При выявлении несовместимости сыворотки ребенка с эритроцитами донора или наличия гемолитической болезни у новорожденного необходимо использовать в пробе на совместимость сыворотку матери. В этих случаях предпочтение следует отдать переливанию эритроцитов 0(I) группы крови с низкими титрами анти-А и анти-В антител (если ребенок имеет не 0(I) группу крови). При подозрении на АВО-гемолитическую болезнь следует использовать эритроцитарную массу 0(I) группы крови, ресуспендированную в 1/3 объема свежезамороженной плазмы АВ(IV) группы, в частности, для обменных трансфузий, поскольку А или В субстанции помогают нейтрализовать анти-А или анти-В антитела.
2. Техника проведения пробы на совместимость по группам крови системы АВО.
На белую промаркированную (с обозначением Ф.И.О. реципиента) пластинку наносятся 2 капли сыворотки крови больного, к которой добавляется маленькая капля крови донора (соотношение 10 : 1). Кровь перемешивается с сывороткой больного, затем пластинку периодически покачивают в течение 5 минут и одновременно наблюдают результат реакции. Отсутствие агглютинации эритроцитов донора свидетельствует о совместимости крови донора и реципиента по группам крови АВО. Появление агглютинации указывает на их несовместимость и на недопустимость переливания данной крови.
3. Пробы на резус-совместимость крови донора и реципиента.
Эта проба проводится с целью выявления в крови реципиента антител к антигенам эритроцитов донора, которые могли выработаться у реципиента вследствие предыдущих переливаний крови или резус-несовместимой беременности.
При проведении проб на совместимость по резус-антигену D следует учитывать, что если резус-отрицательному больному будет ошибочно выбрана резус-положительная кровь, это может быть выявлено только в том случае, если у реципиента имеются в крови резус-антитела. Выявить различие в резус-принадлежности крови донора и реципиента, если последний не имеет антител, пробы на совместимость не могут.
Предупреждение таких ошибок должно быть обеспечено предварительным определением резус-принадлежности крови донора и реципиента и тщательной проверкой записей этих результатов в медицинской карте и на контейнере (бутылке) с кровью.
Ввиду того, что при иммунизации антигенами системы Резус образуются в подавляющем большинстве случаев неполные антитела, которые требуют для своего выявления определенных условий, для пробы на резус-совместимость рекомендуется использовать одну из следующих методик.
3.1. Проба на резус-совместимость с использованием 33% раствора полиглюкина.
Проба проводится в пробирке без подогрева в течение 5 минут. На дно промаркированной пробирки вносятся 2 капли сыворотки больного, 1 капля крови донора и 1 капля 33% раствора полиглюкина, специально приготовленного для лабораторных целей. Содержимое пробирки перемешивается путем встряхивания, затем пробирку следует наклонить почти до горизонтального положения и медленно поворачивать таким образом, чтобы содержимое растекалось по стенкам пробирки. Наблюдение проводится в течение 5 минут. Затем в пробирку следует долить 3-4 мл изотонического раствора хлорида натрия, перемешать содержимое путем 2-3-х кратного перевертывания пробирки (не взбалтывать!) и просмотреть на свет невооруженным глазом.
Оценка результатов: наличие агглютинатов эритроцитов на фоне просветленной или полностью обесцвеченной жидкости указывает на то, что кровь донора несовместима с кровью больного и не может быть ему перелита. Если содержимое пробирки остается равномерно окрашенным, без признаков агглютинации эритроцитов, кровь донора совместима с кровью больного.
3.2. Проба на резус-совместимость с использованием 10% раствора желатина.
На дно пробирки, соответственно промаркированной, поместить 1 каплю эритроцитов донора, затем добавить 2 капли подогретого до разжижения 10% раствора желатина и 1 каплю сыворотки больного. Раствор желатина перед употреблением необходимо тщательно просмотреть. При помутнении, появлении хлопьев, потере способности загустевать желатин не пригоден.
Содержимое пробирки закрыть пробкой, перемешать путем встряхивания и поместить в водяную баню или термостат в горизонтальном положении при температуре +46 - +480С на 15 мин. Затем пробирку извлечь из водяной бани или термостата, добавить 5-8 мл изотонического раствора хлорида натрия, перемешать содержимое путем 1-2-кратного перевертывания пробирки и просмотреть на свет невооруженным глазом или через лупу.
Оценка результатов: наличие агглютинатов на фоне просветленной или полностью обесцвеченной жидкости означает, что кровь донора несовместима с кровью реципиента и не должна быть ему перелита. Если содержимое пробирки остается равномерно окрашенным, слегка опалесцирует и в ней не наблюдается агглютинация эритроцитов, кровь донора совместима с кровью реципиента.
4. Непрямая проба Кумбса как проба на совместимость переливаемой крови.
Оснащение:
пробирка № 1 высотой не менее 10 см с маркировкой, содержащей сведения о доноре (фамилия, инициалы, групповая и резус-принадлежность);
пробирка № 2 высотой 3-4 см с маркировкой, содержащей сведения о больном (фамилия, инициалы, групповая и резус-принадлежность);
лабораторная центрифуга;
термостат 370С;
белые пластинки со смачиваемой поверхностью;
изотонический раствор хлорида натрия;
антиглобулиновая сыворотка;
пастеровские пипетки.
Техника проведения реакции
Через иглу устройства для переливания кровь, эритроцитарную массу донора из бутылки, предназначенной для трансфузии, или из отрезка трубки контейнера набрать в количестве 1-2 мл в пробирку № 1.
Пробирку долить доверху изотоническим раствором хлорида натрия, содержимое перемешать, центрифугировать, отсосать отмывную жидкость. Такое отмывание повторить дважды, каждый раз удаляя отмывную жидкость.
Со дна пробирки № 1, содержащей отмытые эритроциты донора, очень тонкой пастеровской пипеткой набрать маленькую каплю (0,01 мл) эритроцитов и перенести ее в пробирку № 2.
В пробирку № 2 к эритроцитам донора добавить 3 капли сыворотки больного, пробирку встряхнуть для перемешивания эритроцитов с сывороткой, после чего поместить в термостат при 370С на 45 минут. За это время изоиммунные антитела, если они имеются в сыворотке реципиента, фиксируются на эритроцитах донора.
После инкубации в пробирку № 2 добавить доверху изотонический раствор хлорида натрия, содержимое пробирки перемешать, центрифугировать и удалить отмывную жидкость. Такое отмывание эритроцитов повторить 3-4 раза.
К осадку отмытых эритроцитов добавить 3-4 капли изотонического раствора хлорида натрия для получения приблизительно 5% взвеси.
Одну каплю 5% взвеси эритроцитов перенести на белую пластинку, добавить по одной капле антиглобулиновой сыворотки.
Сыворотку перемешать с эритроцитами и наблюдать результат реакции при покачивании пластинки в течение 20-ти минут.
При несовместимости по резус-фактору агглютинация обычно наступает в течение первой минуты. Однако при низком титре резус-антител (или других антител) агглютинация может наступить позже.
Трактовка результатов
Если наблюдается агглютинация эритроцитов (агглютинаты видны в виде комочков на просветленном или полностью обесцвеченном фоне), это указывает на то, что кровь донора несовместима с кровью реципиента и не может быть ему перелита.
Если взвесь эритроцитов осталась гомогенно окрашенной, без признаков агглютинации, это значит, что кровь больного не содержит неполных антител к эритроцитам донора в отношении резус-фактора и других аллоантигенов, к которым могли образоваться антитела неполной формы.
Непрямая проба Кумбса является чувствительной только в отношении неполных антител.
5. Универсальная проба на индивидуальную совместимость крови донора и реципиента.
Проба на индивидуальную совместимость сыворотки реципиента с эритроцитами предполагаемого донора является наиболее надежным способом выявления антител, способных вызвать повреждение перелитых эритроцитов и посттрансфузионные реакции (гемолитические). Проведение такой пробы позволяет:
определить АВО совместимость донора и реципиента;
выявить практически все антитела в сыворотке реципиента, направленные против эритроцитов донора.
Во всех случаях, кроме срочных трансфузий, проба проводится в 2 этапа: первый – без использования антиглобулинового реагента, второй – с антиглобулиновым реагентом или с использованием раствора желатина. В случае использования желатина метод менее чувствителен.
Первый этап
Поместить 2 капли сыворотки реципиента в маркированную пробирку.
Добавить 1 каплю 3% взвеси трижды отмытых эритроцитов донора в изотоническом растворе хлорида натрия (фиксация антител происходит лучше в растворе низкой ионной силы – LISS, поэтому предпочтительнее взвесить эритроциты в растворе LISS, обычно поставляемом изготовителем вместе с антиглобулиновым реагентом).
Немедленно центрифугировать при 2000 об/мин в течение 20-30 секунд.
Просмотреть супернатант на наличие гемолиза, мягко покачивая пробирку отделить клеточный осадок от дна пробирки и определить наличие агглютинатов. Наличие гемолиза и/или агглютинатов на этой стадии может означать несовместимость по системе АВО, либо присутствие в сыворотке реципиента полных холодовых антител не АВО специфичности (анти-S, анти-Р1, анти-М, анти-N и др.).
Второй этап
Проба с антиглобулиновым реагентом
Если гемолиз отсутствовал, а после встряхивания пробирки эритроциты образовали гомогенную суспензию, следует инкубировать пробирку 30-45 минут (при использовании LISS время инкубации составляет 10-15 минут) при 370С.
Центрифугировать пробирку при 2000 об/мин в течение 20-30 секунд и просмотреть супернатант на наличие гемолиза и агглютинатов. Наличие гемолиза и/или агглютинатов (после встряхивания пробирки) говорит о присутствии у реципиента полных тепловых антител против эритроцитов донора.
Если гемолиз и агглютинация отсутствуют, следует провести отмывание эритроцитов 3-4 раза большим объемом (не менее 5 мл) в изотоническом растворе хлорида натрия (недостаточное отмывание может привести к инактивации антиглобулинового реагента и ложноотрицательному результату теста, поскольку сыворотка даже в разведении 1:4000 инактивирует равный объем антиглобулинового реагента).
Добавить 1-2 капли антиглобулиновой сыворотки и тщательно перемешать.
Центрифугировать пробирку, как указано выше, мягко разбить осадок и просмотреть пробирку на наличие агглютинатов.
Оценка результатов
Кровь донора считается совместимой, если ни на одной стадии пробы на индивидуальную совместимость с кровью реципиента не наблюдается ни гемолиза, ни агглютинации. Агглютинация свидетельствует о наличии аллоантител в сыворотке реципиента, специфичность которых может быть выявлена в специальной серологической лаборатории исследованием с панелью типированных эритроцитов. Такие реципиенты нуждаются в специальном подборе донора.
Качество антиглобулинового реагента гарантируется изготовителем. Реагент с истекшим сроком годности или после повторного замораживания (оттаивания) использованию не подлежит. С целью контроля (если возникли сомнения в качестве реагента) следует провести антиглобулиновый тест с резус-положительными эритроцитами, сенсибилизированными неполными анти-D антителами.
ГЛАВА 6