Глава 2. физиология микроорганизмов

Химический состав микроорганизмов.Физиологические, об­менные процессы тесно связаны с химическим составом микроб­ной клетки. В нее входят химические элементы — органогены: азот, углерод, кислород, водород. Из этих элементов и их соеди­нений микроорганизмы синтезируют белки, углеводы, липиды, нуклеиновые кислоты, ферменты, витамины и др.

Составными частями бактериальной клетки являются вода (до 75-80%) в свободном или связанном виде, минераль­ные вещества, в том числе неорганической природы (фос­фор, сера, натрий, магний, калий, кальций, железо, хлор и др.), а также микроэлементы (молибден, кобальт, бор, марга­нец, цинк, медь и др.), органические вещества — белки, нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды, ферменты и другие соединения.

Белки — жизненно важные вещества бактериальной клетки: простые белки — протеины; сложные белки — протеиды — соеди­нения протеинов с небелковыми группами: с нуклеиновой кис­лотой (нуклеопротеиды), полисахаридами (глюкопротеиды), жи­роподобными веществами (липопротеиды); ферменты (энзимы), которые тоже являются белками.

Нуклеиновые кислоты представлены РНК, которая содержит­ся в цитоплазме бактерий, и ДНК, находящейся в основном в ядре клеток. РНК играет роль в синтезе белка. ДНК отвечает за наследственные функции.

Углеводы содержатся в виде полисахаридного комплекса в соединении с белками и липидами в оболочках клетки и слизистом слое. Полисахаридные фракции обеспечивают специ­фичность микроорганизмов, что имеет большое значение для диагностики.

В жизни бактериальной клетки определенное место занимают также липиды (жирные кислоты, нейтральные жиры, фосфолипиды и др.).

Химический состав микроорганизмов зависит от состава пита­тельной среды, характера обмена и внешних условий.

Химический состав актиномицетов и спирохет сходен с бакте­риями, имеются различия лишь количественного характера. Рик­кетсии содержат простые и сложные белки, углеводы, липиды, ферменты, а также аналогичные бактериям две нуклеиновые кислоты: ДНК и РНК.

Обмен веществ (питание) микробов.Микроорганизмы осу­ществляют постоянный обмен веществ с внешней средой. Для своего питания они извлекают из внешней среды питательные материалы, синтезируют составные части микробной клетки и получают за счет превращения веществ необходимую энергию для своей жизнедеятельности.

Питательные вещества поступают в клетку через ее оболочку; ненужные микробу продукты обмена также через оболочку выво­дятся наружу. Механизм этого явления основан на разнице ос­мотического давления в клетке и вне ее. Оболочка полупрони­цаема — пропускает воду и растворенные в ней питательные ве­щества. Для проникновения в клетку сложных коллоидных веществ требуется предварительное их расщепление, что осу­ществляется с помощью ферментов микробной клетки. Синтези­рованные в теле клетки белки используются как пластический материал.

Разница в концентрации питательных веществ обеспечивает движение воды и растворенных в ней соединений, причем вода движется в сторону более высокой, а соли — в сторону менее высокой их концентрации. Приток воды в микробную клетку вызывает набухание коллоидов цитоплазмы. В результате этого она тесно примыкает к оболочке клетки, находится в состоянии напряжения, именуемом тургором бактериальной клетки. Если изменить осмотическое давление в окружающей среде, напри­мер, поместить клетку в гипертонический раствор, то наступит обезвоживание и сморщивание — плазмолиз, в гипотонический раствор — набухание и разрыв — плазмоптиз. И в том и в другом случае микробная клетка гибнет. Эти свойства, в частности плаз­молиз, используют в повседневной практике при консервирова­нии пищевых продуктов в крепких растворах соли и сахара.

По типу питания микроорганизмы делят на аутотрофы (литотрофы) и гетеротрофы (органотрофы).

Аутотрофы для своего питания не нуждаются в готовых органических веществах, а создают их из неорганических ве­ществ; в частности, углерод воспринимают непосредственно из диоксида углерода, простые азотистые соединения (аммиак, его соли, соли азотистой кислоты) и воду — из окружающей среды. Создание сложных органических веществ в клетках этих бакте­рий происходит путем хемо- или фотосинтеза. К этой группе микроорганизмов принадлежат нитрифицирующие бактерии, же­лезобактерии, серобактерии и др. Патогенных для животных микробов в этой группе нет. Явление хемосинтеза у аутотрофных бактерий открыл отечественный микробиолог С.Н. Виноградский (1856-1953).

Гетеротрофы для своего питания воспринимают углерод только из готовых органических веществ. Они нуждаются в раз­личных азотистых соединениях (нитраты, аммиак), неорганичес­ких веществах, микроэлементах и витаминах. Гетеротрофы под­разделяют на сапрофитов и паразитов. Сапрофиты (метатрофы) используют мертвые органические субстраты, в основном это гнилостные микробы. Паразиты (паратрофы) — болезнетворные микробы, обитающие в живых тканях человека, животных, рас­тений. Резкой грани между аутотрофами и гетеротрофами, а также между сапрофитами и паразитами не существует. При изменении условий среды меняется обмен веществ, у микробов вырабатываются адаптивные ферменты, и они приспосабливают­ся к другому типу литания. В экспериментах установлена смена аутотрофного на гетеротрофный тип питания. С другой стороны, отдельные виды патогенных для животных микробов могут суще­ствовать во внешней среде как сапрофиты, а некоторые сапро­фиты при определенных условиях вызывают заболевание живот­ных.

Отмечается избирательность микроорганизмов по отношению к питательным веществам, в особенности к источникам углерода и азота. Углерод микроорганизмы получают из углеводов, спир­тов, различных органических кислот. Для выращивания патоген­ных микробов нужен азот белков животного происхождения, хотя удается выращивание и на синтетических средах. Универ­сальным источником азота и углерода служит пептон — продукт ферментного расщепления белков мяса. Он входит в состав пи­тательных сред для выращивания бактерий. Бактерии нуждаются в специальных ростовых веществах или витаминах, играющих роль катализаторов биохимических процессов в клетке. Необхо­димы для питания бактерий также неорганические вещества.

Обмен веществ включает в себя два противоположных и в то же время единых процесса: ассимиляция (конструктивный обмен веществ) и диссимиляция (энергетический обмен веществ). Осу­ществляется обмен веществ с помощью ферментов.

Микроорганизмы нуждаются в аминокислотах.

Белковый обмен у бактерий протекает в две фазы. Под действием ферментов белковые вещества расщепляются до ами­нокислот. Последние могут подвергаться дальнейшему измене­нию (дезаминирование, декарбоксилирование). Наряду с этим происходит и процесс построения белков, для осуществления которого также необходимы аминокислоты. Одни микробы полу­чают их в готовом виде, другие — синтезируют из простых соеди­нений азота. Синтез белка осуществляется в рибосомах.

Расщепление углеводов также происходит под вли­янием ферментов. Процесс протекает по типу гидролиза или фосфоролиза. Образующиеся моносахариды подвергаются бро­жению, при этом освобождается энергия, используемая микро­организмами. Конечные продукты такого распада — вода и угле­кислота. Расщепление углеводов обусловливает кислую реакцию (бродильные микробы), расщепление белков — щелочную (гни­лостные микробы). Этот биологический антагонизм широко ис­пользуется в жизни — бродильные процессы предохраняют от загнивания силос, квашеные овощи, молочнокислые продукты. Углеводы синтезируются путем фотосинтеза, что присуще бакте­риям, содержащим в цитоплазме пигменты типа хлорофилла, и хемосинтеза, присущего большинству бактерий.

Липидный обмен в микробной клетке осуществляется с помощью ферментов. Многие бактерии усваивают глицерин, служащий для получения энергии и построения структур клетки.

Большое значение для жизнедеятельности микробов имеет также минеральный обмен.

Дыхание микроорганизмов.Это — процесс, сопровождающий­ся выделением энергии, необходимой микробам для синтеза ор­ганических соединений. По типу дыхания микробов делят на аэробные микробы (аэробы), использующие для дыхания молекулярный кислород воздуха (например, возбудитель сибир­ской язвы), и на анаэробные микробы (анаэробы), для жизнедеятельности которых необходимая энергия освобождается в процессе расщепления имеющихся в окружающей среде орга­нических субстратов (например, возбудитель ботулизма). Между этими группами существуют промежуточные формы: микроаэрофилы — нуждаются в очень ограниченном количестве кислорода (например, возбудитель бруцеллеза крупного рогатого скота), и факультативные аэробы — размножаются как в присутствии, так и в отсутствие кислорода. Кним принад­лежит большинство патогенных и сапрофитных бактерий. Значи­тельно влияет на характер дыхания среда обитания микробов. Например, дрожжи могут изменять анаэробный тип дыхания на аэробный.

Процессы дыхания у бактерий представляют собой цепь пос­ледовательных окислительно-восстановительных реакций, проте­кающих с участием строго специфических ферментных систем и осуществляемых путем переноса электронов от систем с наибо­лее отрицательным потенциалом к системе с наиболее положи­тельным потенциалом.

Ферменты (энзимы) микробов.Это — вещества, стимулирую­щие различные химические процессы, происходящие в клетке, а также в окружающей среде под их влиянием. Обладают высокой активностью и специфичностью. Они неустойчивы, разрушаются под действием высокой температуры, в присутствии щелочей, кислот, солей тяжелых металлов. Различают экзоферменты, выделяемые клеткой в окружающую среду для внешнего перева­ривания питательных веществ, и эндоферменты, которые заключены внутри клетки. Ферменты, находящиеся в клетке по­стоянно, независимо от условий ее существования, — кон­структивные ферменты; другие ферменты — адаптив­ные (индуктивные) — появляются тогда, когда в них возникает необходимость. По химическому составу различают ферменты, состоящие только из белка, и ферменты, в состав которых поми­мо белка входят и другие вещества, например ионы металлов, витамины.

Ферменты широко применяются в промышленности: пивова­рении, спиртовом производстве, хлебопечении, при выделке кож. Фибролизином растворяют тромбы в кровеносных сосудах. Ферменты, гидролизующие клетчатку, используют для лучшего усвоения животными грубых кормов. Ферментативные свойства патогенных микробов учитывают при их идентификации в лабо­раторной практике.

Токсины микроорганизмов.Ряд патогенных микробов выраба­тывают особые ядовитые вещества — токсины. Их делят на эк­зотоксины, выделяемые во внешнюю среду, и эндотокси­ны, связанные с телом микробной клетки (подробно см. в главе 1«Учение об инфекции» раздела II).

Гнилостный распад белка (например, мяса), вызываемый оп­ределенными микробами, обусловливает образование ядовитых веществ — птомаинов, что служит причиной алиментарных ин­токсикаций.

Некоторые виды бактерий и грибов вырабатывают красящие вещества — пигменты. Колонии этих микробов на твердых средах окрашиваются в разные цвета: красный (чудесная палочка), синий (синегнойная палочка), золотистый (золотистый стафилококк), белый (белый стафилококк), черный и бурый (дрожжи и грибы). Есть микробы, которым свойственно свечение (люминесценция). Это — фотобактерии. Они вызывают свечение истлевшего дерева, мяса, чешуи рыб, морской воды и других объектов. Некоторые микробы выделяют летучие ароматические вещества, обусловли­вающие запах вин, молочнокислых продуктов, сена и других объ­ектов. К ним относится Leuconostoc citrovorus, используемый в молочной промышленности для придания аромата сливочному маслу и другим молочным продуктам. Существует также группа термогенных (термофильных) микробов, способных при опреде­ленных условиях вызывать повышение температуры, обусловли­вая, например, самонагревание навоза, влажного сена. Микроб­ные процессы сбраживания навоза сопровождаются выделением метана, который используется для отопления помещений.

Размножение и рост микроорганизмов.Размножение микро­бов — увеличение количества микробных клеток в единице объе­ма, рост — увеличение самой клетки (увеличение массы цито­плазмы). Бактерии размножаются простым поперечным делени­ем, например, палочковидные бактерии делятся на две особи. Кроме того, бактерии могут размножаться почкованием, путем расщепления сегментированных нитей, посредством образования клеток, подобных спорам, и другими способами. Актиномицеты и грибы размножаются в основном спорами. Дочерние клетки отделяются от материнских и, в свою очередь, становятся мате­ринскими. После нескольких генераций материнские клетки ста­реют и гибнут.

Бактерии размножаются очень быстро. Длительность генера­ции у кишечной палочки всего 15 мин. Скорость деления зависит от вида бактерий, возраста культуры, питательной среды, темпера­туры и других факторов. Размножение бактерий в жидких средах идет по определенным закономерностям и в несколько фаз (рис. 4):

I. Исходная фаза; длится 2 ч, размножения не происходит.

II. Фаза задержки размножения (лаг-фаза) — клетки приспосабливаются к новым условиям, скорость их роста возрас­тает; длится 2 ч.

Рис. 4. Фазы размножения бактерий

III. Логарифмическая фаза — максималь­ная скорость деления и уменьшение размеров клеток; длится 5-6 ч.

IV. Фаза отрицательного ускорения — снижение

скорости размножения бак­терий, число делящихся кле­ток уменьшается; длится 2 ч.

V. Стационарная фа­за — число новых бактерий становится равным числу от­мирающих; длится 2 ч.

VI. Фаза ускорения ги­бели бактерий; длится 3 ч.

VII. Фаза логариф­мической гибели — от­мирание бактерий идет с постоянной скоростью; длится 5 ч.

VIII. Фаза уменьшения скорости отмирания, при которой оставшиеся живыми клетки переходят в состояние покоя.

Бактерии выращивают в питательных средах, используя для этого термостаты — приборы, где поддерживается определенная постоянная температура. Микробы способны размножаться при температуре от 4 до 80 °С; патогенные, как правило, при 37 °С.

Большое значение для выращивания бактерий имеет рН — концентрация водородных ионов. Большинство патогенных микро­бов растет при рН 6,8-8,0.

Питательные среды бывают простыми (мясо-пептонный бульон и агар), специальными (сывороточный агар и бу­льон, кровяные среды) и дифференциально-диагностическими (среды с углеводами, среда Эндо и др.). Среды, на которых хорошо растут определенные виды бактерий и не растут или плохо растут другие виды, называют элективными.

Различают плотные, жидкие и полужидкие среды. Бактерии на плотных средах образуют скопления, называемые колониями. Колонии могут иметь различные вид, цвет, размер, форму, края, поверхность. Эти признаки используются в лабораторной прак­тике для дифференциации бактерий. На жидких средах бактерии растут с образованием помутнения, пленки, осадка. В лаборато­риях выращивают бактерий в пробирках, флаконах, колбах, чаш­ках Петри; в производственных условиях — в стеклянных матра­сах, бутылях, реакторах большой вместимости. Риккетсии куль­тивируют в куриных эмбрионах, на искусственных питательных средах, содержащих переживающие ткани, и путем заражения лабораторных животных.

В настоящее время возросло значение микробиологической промышленности, производящей различные биопрепараты — вакцины, сыворотки и др. Ее основу составляет биотехнология — отрасль науки, разрабатывающая технологию производства (про­цессы, аппараты) биопрепаратов в промышленных масштабах. Наряду с традиционными возникли новые направления биотехно­логии, в частности генетическая инженерия, позволяющая прида­вать микробам новые свойства и повышать выход продукции.

Лабораторная работа.

Приготовление простых питательных сред.
Изучение лабораторной аппаратуры и правил пользования ею

Простые питательные среды — мясо-пептонный бульон и агар — готовят на мясной воде.

Мясная вода.Мясо освобождают от костей, жира, пленок и сухожилий, пропускают через мясорубку, заливают 2- или 4-кратным количеством воды (по массе) и кипятят в течение 1 ч. Жидкость фильтруют через вату или полотно, затем через фильт­ровальную бумагу. Фильтрат измеряют и доливают до первона­чального объема дистиллированной водой.

Другой способ — мясной фарш заливают 2- или 4-кратным количеством дистиллированной воды, тщательно перемешивают и оставляют на сутки в прохладном месте. На следующий день фарш отжимают, настой кипятят 30 мин и фильтруют.

Приготовленную мясную воду разливают по бутылкам и сте­рилизуют 30-40 мин в автоклаве при давлении 100 кПа (1 атм).

Мясо-пептонный бульон (МПБ).К мясной воде добавляют 1% пептона, 0,5% химически чистой поваренной соли и кипя­тят до растворения пептона. Затем в горячем бульоне определяют рН и добавлением 10%-ного раствора углекислой соды или децинормального (0,1 н.) раствора едкого натра устанавливают рН 7,2-7,4. После этого бульон еще раз кипятят 15-20 мин и фильтруют через двойной бумажный фильтр. Готовый бульон разливают по пробиркам и колбам, стерилизуют 15-20 мин в автоклаве при давлении 100 кПа (1 атм)

Мясо-пептонный агар (МПА).В мясо-пептонный бульон до­бавляют 2-3% агар-агара и расплавляют его нагреванием в автоклаве или текучепаровом аппарате. В расплавленном агаре определяют рН и устанавливают его равным 7,2-7,4 добавлени­ем 10%-ного раствора углекислой соды или децинормального раствора едкого натра. Для просветления среды добавляют на 1 л расплавленного и охлажденного до 50 °С агара белок одного куриного яйца или К) мл кровяной сыворотки, после чего нагре­вают в автоклаве при температуре 105 °С для свертывания белка, фильтруют в горячем виде через ватно-марлевый фильтр (в на­гретом автоклаве), разливают по колбам и пробиркам, затем стерилизуют в автоклаве при давлении 100 кПа (1 атм) в течение 30 мин.

Определение рН (реакции) питательной среды.Применяют два метода: колориметрический и электрометрический. Принцип оп­ределения рН колориметрическим способом (по Михаэлису) заключается в сравнении окраски среды после до­бавления в нее индикатора с окраской готовой шкалы запаянных пробирок с различными показателями рН (отличаются по цвету). Для определения рН применяют индикаторы нитрофенолового ряда. Так как питательные среды для выращивания микробов в большинстве случаев имеют слабощелочную реакцию, при опре­делении рН пользуются индикаторами ряда метанитрофенола, которым определяют рН от 6,7 до 8,4. Растворы индикатора готовят на дистиллированной воде и хранят в бутылях с притер­тыми пробками. Сравнение окраски среды и стандарта проводят в компараторе. Меняя стандартные пробирки, подбирают такую, которая по окраске больше всего соответствует испытуемой среде. По обозначению на этикетке стандарта узнают рН.

Электрометрическим методом рН определяют с помощью специальных приборов, к числу которых относится отечественный лабораторный ионометр ЭВ-74. Он состоит из металлического корпуса, где находятся элементы измерительной схемы прибора, а также лабораторного датчика, в комплект ко­торого входят специальные электроды. Их погружают в испытуе­мый раствор и по шкале прибора определяют рН.

При приготовлении питательных сред приходится произво­дить подщелачивание, так как мясная вода из свежего мяса имеет рН 6,6-6,8. Обнаружив в пробе кислую реакцию, берут новую пробную порцию среды, подщелачивают ее точным коли­чеством децинормального раствора едкого натра или 10%-ного раствора углекислой соды и снова проверяют. После установле­ния нужной реакции высчитывают, какое количество щелочи необходимо для подщелачивания всей среды. Чтобы избежать ошибок, добавлять щелочь следует осторожно; сначала ее берут в несколько меньшем количестве, затем еще раз определяют реак­цию среды, после чего добавляют оставшуюся часть раствора щелочи.

При стерилизации сред под давлением рН может снижаться на 0,2-0,4. Поэтому после первого усреднения пробу рекоменду­ется прокипятить 30 с, а затем после охлаждения снова опреде­лить и установить нужный рН. Для определения рН в твердых средах их надо растопить и развести теплой дистиллированной водой.

Сухие питательные среды.В лабораторной практике широко используют готовые сухие питательные среды, выпускаемые про­мышленностью. Их растворяют в дистиллированной воде, разли­вают по пробиркам, колбам или бактериологическим: чашкам, и при необходимости стерилизуют в автоклаве или текучепаровом аппарате.

Розлив питательных сред.Среды по пробиркам и колбам раз­ливают с помощью приспособления, состоящего из штатива и стеклянной воронки, на конце которой укреплена резиновая трубка со стеклянным наконечником. С этой же целью исполь­зуют специальные дозирующие устройства — дозаторы.

Рис. 5. Схема устройства микроскопа: 1 — ножка микроскопа; 2 — макрометричсский винт; 3 — тубусодержатсль; 4 — оку­ляр; 5 — тубус; 6 — микрометрический винт; 7 — револьвер; 8 — предметный сто­лик; 9 — конденсор; 10 — зеркало; 11 — объектив

Лабораторная аппаратура и правила пользования ею.Микро­скоп и его устройство. Микроскоп — оптический при­бор, с помощью которого рассматривают и изучают мельчайшие организмы и предметы, невидимые простым глазом. Микроско­пы, производимые отечественной промышленностью для биоло­гических исследований: биолам Р — микроскоп биологический рабочий с моно- или бинокулярной насадками, увеличение от 50 до 1800 раз; биолам Д — микроскоп биологический дорожный; биолам С — микроскоп биологический студенческий; люмам Р — рабочий и люмам И — исследовательский люминесцентные мик­роскопы.

Каждый микроскоп имеет две основные системы: меха­ническую и оптическую (рис. 5). Механическая систе­ма микроскопа состоит из шта­тива, включающего ножку (1) и тубусодержатель (3) или ко­лонку. К ней прикреплен тубус (5) с вращающимся ба­рабаном-револьвером (7) на нижнем конце. Тубус пере­двигается макрометрическим винтом (2), для тонкой навод­ки служит микрометрический винт (б). К ножке прикреплен предметный столик (8), на который помещают исследуемый пре­парат, закрепляемый зажимами.

Оптическая система состоит из зеркала (10), конденсора (9) с ирисовой диафрагмой, объективов (11) и окуляра (4). Степень увеличения объективов указана на их оправе: х8, х10, х20, х40, х60, х90. Различают два типа объективов: сухие и иммерсионные (масляные). При работе с иммерсионными объективами каплю масла (кедрового, вазелинового или касторового) наносят на мазок и с помощью макрометрического винта осторожно под контролем глаза погружают объектив в масло, не прикасаясь к стеклу. Наблюдая в окуляр, медленно поднимают макровинтом тубус до появления изображения. Для тонкой наводки использу­ют микрометрический винт. Окуляры отечественных микроско­пов обозначаются 7х, 10х, 15х, 20х, т.е. цифрами, указывающи­ми на степень их собственного увеличения. Умножив цифру на оправе объектива на цифру окуляра, получим число, показываю­щее, во сколько раз увеличивает микроскоп.

Перед работой с микроскопом надо установить освещение. При дневном свете пользуются плоским зеркалом, при искусст­венном — вогнутым. В качестве источников искусственного света используют лампы-осветители. Когда свет установлен, берут пре­парат, помещают на предметный столик и изучают сначала под малым, а затем под большим увеличением, используя для этого сухую или иммерсионную систему.

Рис. 6. Мазок из культуры листерий, окрашенный по методу люминесцирующих антител

Люминесцентные микроскопы используют для изучения объектов, обладающих собственным свечением, или объектов с вторичным свечением, возникающим после обработ­ки их специальными красками — флуорохромами (акридин, аурамин, флуоресцеин и др.). Изучают также люминесцирующие антитела — специфические гамма-глобулины, выделенные из гипериммунных сывороток, соединенные с красителями. При окрашивании мазков такие меченые антитела адсорбируются на поверхности антигена (микробной клетки), что выявляется при исследовании в люминесцентном микроскопе в виде яркого све­чения (рис. 6).

Кроме обычных световых микроскопов в научно-исследова­тельской работе и для диагностических целей применяют элек­тронные микроскопы, в которых вместо световых лучей используют поток движущихся электронов.