Общие методы получения карбоновых кислот

Из растительного сырья

В виду большого разнообразия структур карбоновых кислот не существует единого метода выделения их из растительного сырья. Из сравнения методик, пригодных для отдельных классов кислот видно, что общей (кроме уроновых кислот) в них является лишь первоначальная стадия экстракции растительного сырья этиловым спиртом при температуре 40-600С.

Выделение суммы свободных органических кислот возможно проводить методом анионообменной хроматографии на ионите АВ-17 или подобном. Для этого сток стеклянной колонны покрывают увлажненным войлоком, заполняют подготовленным к работе ионитом АВ-17 до высоты 100 мм. При полностью открытом кране колонны вливают 5М кислоту уксусную до положения чуть выше поверхности ионита и промывают 50 мл 0.1М раствора кислоты уксусной. Выделение свободных органических кислот из спиртового экстракта проводят следующим образом: 10 мл образца вносят на подготовленный к работе анионит и пропускают со скоростью 1 кап/сек. Затем промывают колонку с такой же скоростью 50 мл 0.1М раствора кислоты уксусной, а затем 50 мл воды очищенной. Связанные с анионитом кислоты элюируют со скоростью 1 кап/сек 100 мл 1М раствора натрия сульфата.

Для получения суммы свободных жирных кислот спиртовый экстракт подвергают омылению при нагревании в колбе с обратным холодильником с избытком водного раствора щелочи. После омыления, образец нейтрализуют раствором соляной или серной кислот, дополнительно добавляют 3-5% (v/v) водный раствор кислоты фосфорно-вольфрамовой. Сумму кислот отделяют центрифугированием и/или фильтрованием.

Для выделения феноло-, оксикоричных и лишайниковых кислот к сконцентрированному спиртовому экстракту, добавляют равный объем 5% водного раствора натрия бикарбоната. При этом феноло-, оксикоричные и лишайниковые кислоты образуют хорошорастворимые в воде соли. Сопутству-ющие соединения трижды экстрагируют этилацетатом (по 15-20 мл). Водную часть подкисляют (до рН=4-5). Феноло-, оксикоричные и лишайниковые кислоты трижды экстрагируют этилацетатом по 10-15 мл. Этилацетатный экстракт промывают в делительной воронке несколько раз водой для удаления минеральной кислоты и концентрируют в мягких условиях.

Для выделения суммы уроновых кислот растений проводится экстракция водой при температуре 50-60⁰С в течение 2-3 часов. Водный экстракт концентрируют в мягких условиях, к концентрату добавляют четырехкратный объем спирта этилового 96%. Образовавшийся осадок сахаров отделяют центрифугированием. Для удаления белков к осадку добавляют 5-10 мл 10% кислоты трихлоруксусной, перемешивают, центрифугируют. Маточный раствор нейтрали-зуют добавлением насыщенного раствора натрия карбоната и концентрируют. Для осаждения уроновых кислот к концентрату добавляют 5 мл насыщенного раствора кальция(бария) хлорида, осадок отделяют центрифугированием, уроновые кислоты получают из солей действием натрия сульфата.

КАРОТИНОИДЫ

Каротиноидами называют большую группу природных пигментов желтого или оранжевого цвета. По химической природе они являются тетратерпенами. В растениях часто содержится 3 изомера (a-, b- и g-), выполняющие роль переносчиков кислорода, с чем связано множество их кислородсодержащих производных (ксантофиллов).

Основной структурной особенностью каротиноидов является ненасыщенная углерод-углеродная цепь и большая молекулярная масса. Они легко окисляются на воздухе. Локализуются в плодах, цветках, реже – в подземных органах и извлекаются неполярными органическими растворителями, 96% спиртом и маслами.

Выделение:

Около 1 г измельченного растительного сырья заливают 10 мл хлороформа и экстрагируют в колбе при нагревании на водяной бане (50-60⁰С) в течение 1 часа, фильтруют.

Для качественного анализа используют 1-3 мл извлечения.

Качественный анализ [12]:

q Реакция Карра-Прайса. Добавляют 2 мл раствора сурьмы хлорида в хлороформе, появляется зеленовато-си­нее окрашивание, быстро переходящее в бурое.

q Добавляют 2-3 мл раствора калия перманганата или бромной воды, при встряхивании происходит обесцвечивание раствора.

q Добавляют 4-5 капель 10% спиртового раствора кислоты фосфорно-молибденовой, появляется синее окрашивание (эту реакцию можно наблюдать и при БХ и ТСХ, синие пятна на желто-зеленом фоне).

q Извлечение петролейным эфиром поглощает в УФ-свете при длине волны 400-410 нм.

Хроматографический анализ:

Основным методом хроматографического анализа расти-тельных каротиноидов является метод ВЭЖХ, хотя в литературе описано несколько селективных для данного класса соединений ТСХ систем. Основными подвижными фазами, используемыми при разделении и препаративном выделении каротиноидов в тонком слое, являются:

1) петролейный эфир (65-95⁰C) – ацетон – диэтиламин (10:4:1)

2) диэтиловый эфир – гексан (60:40)

3) гексан – метанол – тетрагидрофуран (75:20:5)

4) гексан – метанол (8:2)

Эффективного разделения суммы каротиноидов методом ВЭЖХ можно достичь на колонке Spherisorb ODS-2, с использованием смеси ацетон – вода (3:7) в качестве подвижной фазы и фотодиодного детектора [88]. Аналогичная подвижная фаза с градиентом концентрации ацетон/вода от (86:14) до (97:3) была использована в работе [89], при разделении стерео-изомеров каротиноидов на колонке ProntoSIL C₃₀ при 450 нм.

Хорошие результаты были также получены на YMC C₃₀ колонке, подвижной фазой служила смесь: метанол – вода – метил-трет-бутиловый эфир, с градиентом концентрации от (90:5:5) до (95:0:5) за 12 мин, от (95:0:5) до (75:0:25) за 30 мин. В работе был использован фотодиодный детектор (250-540 нм) [90].

Использование колонки с mBondapack C₁₈ позволило провести препаративное выделение каротиноидов перца [91]. Эффективными для разделения оказались следующие подвиж-ные фазы: ацетонитрил – метанол (7:3) и ацетонитрил-вода (4:6) с добавлением 1% уксусной кислоты. В работе использовался УФ детектор (280 и 450 нм).

C₁₈ колонка с SphereClone ODS сорбентом оказалась эффективной в исследовании каротиноидов при использовании градиента подвижной фазы А: ацетонитрил-вода (9:1) и В: этилацетат от (10:90) до (35:65) за 25 минут [92].

В извлекаемой сумме каротиноидов, как правило, преобла-дает b-изомер, поэтому в описанных методах количественного определения расчет содержания ведут с пересчетом на доминирующий изомер.

Метод 1. Около 5 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в коническую колбу с притертой пробкой вместимостью 100 мл, приливают 50 мл смеси гексан – спирт этиловый 96% (1:1), выдерживают в течение 2 часов при постоянном перемешивании, фильтруют.

В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 15 мл фильтрата и доводят объем до метки смесью гексан – спирт этиловый 96% (1:1).

[Около 1 г (точная навеска) препарата растворяют в смеси указанных растворителей в мерной колбе на 50 мл, доводят объем раствора до метки той же смесью, перемешивают]. (*)

Измеряют оптическую плотность раствора при длине волны 450 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм, используя в качестве раствора сравнения смесь гексан – спирт этиловый 96% (1:1).

Параллельно измеряют оптическую плотность раствора СО калия бихромата.

Содержание каротиноидов в пересчете на b–каротин в мг% (Х) рассчитывают по формуле:

X =

D₁ ^. 0.00208 ^. 25 ^. 50 ^. 100 ^. 100

D₀ ^. m ^. 15 ^. (100 - W)

где D₁– оптическая плотность исследуемого раствора при длине волны 450 нм;

D₀ - оптическая плотность раствора СО калия бихромата при длине волны 450 нм;

0.00208 – количество b–каротина в миллиграммах, в растворе, соответствующем по окраске раствору СО калия бихромата;

m – масса навески сырья, в граммах;

W – потеря в массе при высушивании сырья, в процентах.

Примечания. Приготовление раствора (СО) калия бихромата. 0.0036 г (точная навеска) СО калия бихромата растворяют в воде очищенной в мерной колбе вместимостью 1 л, доводят объем раствора водой очищенной до метки, перемешивают.

По окраске раствор соответствует раствору, содержащему 0.00208 мг b–каротина в 1 мл [93-96].

* Методика пригодна и для анализа препаратов.

Метод 2. Около 0.5 г препарата (плоды, цветки, масла, суппозитории) (точная навеска) помещают в коническую колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 25 мл смеси гексан – спирт этиловый 96% (1:1) и растворяют при перемешивании, фильтруют. (Для растворения также можно использовать смесь гексана со спиртом этиловым 96% (3:1), гексан, хлороформ, спирт этиловый 96%, петролейный эфир) (*).

Содержимое колбы количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора смесью до метки, перемешивают.

Измеряют оптическую плотность полученного раствора при длине волны 450 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм, используя в качестве раствора сравнения смесь гексан – спирт этиловый 96% (1:1) или другой растворитель.

Содержание каротиноидов в препарате, в пересчете на b–каротин в процентах (Х) вычисляют по формуле:

X =

D ^. 100 ^. 100 ^. [100]

Е ^. m ^. [100 – W]

где D – оптическая плотность исследуемого раствора при длине волны 450 нм;

m – масса навески препарата, в граммах;

W – потеря в массе при высушивании, в процентах;

2550 – удельный показатель поглощения b–каротина в смеси гексан – 96% спирт (1:1) при длине волны 450 нм;

2500 – удельный показатель поглощения b–каротина в абсолютном спирте этиловом при длине волны 450 нм;

2592 – удельный показатель поглощения b–каротина в гексане при длине волны 450 нм.

* При низком содержании каротиноидов, можно измерять оптическую плотность фильтрата, доведенного в мерной колбе на 50 мл использованным растворителем [69,94,96].