Общие методы получения ксантонов
Из растительного сырья
Для выделения суммы ксантонов из растительного сырья предложено несколько методик, заключающихся в первона-чальной фракционной экстракции сырья в аппарате Сокслета разнополярными растворителями, с последующим адсорбционно-распределительным хроматографированием на колонках с сефадексом либо гель-фильтрацией.
Так, для получения суммы ксантонов кассии воздушно-сухое сырье последовательно экстрагируют в аппарате Сокслета петролейным эфиром и хлороформом(дихлорметаном) и этилацетатом в течение 48 часов. Концентрированные эфирные и хлороформные экстракты для получения ксантоновых агликонов, по отдельности хроматографируют на колонке с силикагелем L60/120, элюируя гексаном и смесью гексан-этилацетат (98:2 и 95:5). Ксантоновые гликозиды получают хроматографируя концентрированную этилацетатную фракцию на колонке с силикагелем L60/120 при градиентном элюировании смесью: дихлорметан-этилацетат состава от 100:0 до 70:30 с шагом 5%. Наибольшее количество ксантоновых гликозидов содержит фракция состава (85:15) [101].
Другими эффективными экстрагентами ксантоновых соединений из растительного сырья являются этиловый и метиловый спирты. В этом случае, концентрированный спиртовый экстракт фракционируют между водной и органическими (хлороформ, этилацетат) фазами. Хлороформ-ную фракцию наносят на колонку с силикагелем L60/120, элюирование ксантонов проводят смесью гексана и этилацетата от 1:10 до 1:1. Этилацетатную фракцию наносят на колонку с силикагелем L70/230 и элюируют смесями н-гексан-этилацетат (20:1, 10:1 и 5:1), дихлорметан-ацетон (10:1, 5:1 и 0:1) и дихлорметан-метанол (10:1, 5:1 и 0:1). Полученные фракции рехроматографируют на Сефадексе LH-20, с использованием в качестве подвижной фазы 75% водного метанола. Индивидуальные ксантоны перекристаллизовывают из ацетон-гексановых смесей. [102,103].
КУМАРИНЫ
В основе разнообразия кумаринов лежит бензольное и пироновое кольцо, составляющие скелет любого кумарина.
 |
Спутниками кумаринов в растениях являются оксикоричные кислоты, из которых они образуются в процессе биогенеза:
В растениях чаще присутствуют кумарин, его оксипроиз-водные, фуро-, пиранокумарины и гликозидированные формы.
Наиболее распространены:
 |
В меньших количествах в растениях присутствуют пирано-кумарины (5,6; 6,6 и 7,8) с заместителями во всех кольцах, бензокумарины, куместаны (куместролы), афлотоксины.
Кумарины хорошо растворимы в органических растворителях: хлороформе, этиловом эфире, спирте этиловом, жирах и жирных маслах, в водных растворах щелочей, причем нагревание в этом случае часто приводит к раскрытию гетерокольца и образованию оксикоричных кислот. В воде, в большинстве случаев, нерастворимы; гликозиды растворяются, как правило, в воде и практически нерастворимы в органических растворителях.
При нагревании до 1000С кумарины возгоняются в виде игольчатых кристаллов.
Выделение:
Около 2 г измельченного растительного сырья заливают 20 мл спирта этилового 70-95%, экстрагируют на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 30-40 мин, фильтруют.
Для качественного обнаружения используют 2-3 мл фильтрата.
Качественный анализ [11,12]:
Поскольку для идентификации заместителей в бензольном кольце нет строго специфичных реакций, отличительной особенностью кумаринов является наличие лактонного кольца.
Определение кумаринов и фурокумаринов описано в смоковнице (инжир), пастернаке посевном, амми большой и зубной, псоралее костянковой, вздутоплоднике сибирском и др [11,32].
В зависимости от структуры, кумарины имеют голубую, синюю, фиолетовую, зеленую, желтую флюоресценцию в УФ-свете. После обработки пятен на бумаге щелочью и высушивания, флюоресценция усиливается.
Под действием щелочей в растворах кумарины и дикумарины разрушаются с образованием белого осадка, а затем раствора:
q 
Добавляют 1-3 мл 10% раствора калия едкого в метаноле, нагревают 5 минут на водяной бане, появляется желтое окрашивание. затем добавляют 5-6 капель свежепри-готовленного реактива Паули по Кутачеку (см. фенолы), появляется от коричнево-красного до вишневого окрашивание (окси- и метоксикумарины).
q "Лактонная проба". Добавляют 10 капель 10% раствора калия едкого в метаноле, нагревают 5 минут на водяной бане, перемешивают и нейтрализуют 10% раствором кислоты хлороводородной до кислой реакции, появляется помутнение или выпадает осадок (большинство кумаринов).
q Добавляют 1-3 мл пиридина, затем по каплям 1-3 мл 0.1 н раствора натрия гидроксида. При этом окраска переходит от желтой через зеленую к синей в присутствии 1-3 капель спиртового раствора бромтимолового синего (дикумарин, оксикумарины).
q Добавляют 1-3 капли 1% спиртового раствора хлорида железа окисного, появляется различное окрашивание для кумаринов и изокумаринов, сине-фиолетовое (дикумарин).
q Добавляют 3-5 капель реактива Драгендорфа или 1% йода, появляется коричневое окрашивание или осадок.
q Добавляют 2-3 мл 0.1 н раствора натрия гидроксида, нагревают на водяной бане (60-700С) в течение 5 минут, быстро охлаждают на льду и добавляют 2 мл свежеприготовленного раствора диазосульфокислоты, появляется интенсивное красное окрашивание (фурокумарины).
q Добавляют 1-3 мл свежеприготовленного диазосуль-фаниламида, появляется оранжевое, красно-оранжевое или фиолетовое окрашивание (производные кумаринов). От действия раствора йода или реактива Драгендорфа, цвет меняется на коричневый.
q Добавляют 1-3 мл кислоты серной концентрированной, появляется изумрудно-зеленое окрашивание (фурокумарины).
q Добавляют 1-3 мл 10% раствора калия гидроксида, появляется красное окрашивание (фурокумарины).
q Добавляют 1-3 мл щелочного раствора натрия нитропруссида, появляется оранжевое окрашивание, добавляют 1-3 мл кислоты уксусной, окраска меняется на фиолетово-красную (фурокумарины в отличие от кумаринов).
Хроматографический анализ:
Методы бумажной и тонкослойной хроматографии в исследовании растительных кумаринов позволяют быстро устанавливать однородность экстракта(элюата), проводить сравнительный качественный анализ образцов и препаративное выделение индивидуальных соединений.
Ввиду плохой растворимости кумаринов в водных и лучшей – в неполярных фазах разделение их осуществляется путем распределительной хроматографии на импрегнированной бумаге. В качестве подвижной фазы используют бензин, петролейный эфир (70-1100), смесь: петролейный эфир – бензол – метиловый спирт (5:4:1). Хроматографическая бумага, как правило предварительно пропитывается 20% водным раствором этиленгликоля или пропиленгликоля, либо 10% раствором формамида в спирте метиловом.
Помимо бумажной хроматографии широко используется метод хроматографии в тонком слое оксида алюминия или силикагеля. Хорошее разделение кумаринов в тонком слое было достигнуто при применении следующих систем растворителей:
1) хлороформ – петролейный эфир (1:2)
2) петролейный эфир – этилацетат (2:1, 7:3 и 8:2)
3) н-гептан – бензол (4:1)
4) н-гексан-этилацетат (7:1)
5) хлороформ – метанол (19:1)
6) хлороформ – диэтиловый эфир (7:3)
7) толуол – метанол – ацетон (10:10:0.8)
8) дихлорметан-метанол (97:3)
Кумарин и его производные могут быть разделены методом ВЭЖХ на колонках с “обращенной” фазой, состоящей из неподвижной фазы Kromasil C18 и подвижной фазы состава вода-ацетонитрил (1:3) при расходе подвижной фазы 2 мл/мин (400С) и УФ-детектировании (254 нм). Высокое разрешение было получено в системе ODS RP18 сорбент / метанол + вода (8:2) [104,105].
Предложена методика разделения и анализа кумаринов на колонке (300х3.9) с m-Бондапаком С18 в потоке смеси диоксана и 0.01М раствора гидрофосфата натрия (36.3:63.7) (рН=7.3) при расходе подвижной фазы 1.3 мл/мин и использовании УФ-детектора (340 нм) [106].
Количественное определение [7,11,32,107,108]:
Метод 1. Около 2 г измельченного сырья (точная навеска) помещают в колбу вместимостью 100 мл, добавляют 50 мл хлороформа и нагревают при перемешивании в течение 2 часов на кипящей водяной бане с обратным холодильником, фильтруют через бумажный фильтр.
20 мл фильтрата помещают в делительную воронку, прибавляют 1 г натрия хлорида, встряхивают в течение 5 минут, фильтруют.
Хлороформное извлечение упаривают на кипящей водяной бане досуха.
Сухой остаток растворяют в 10 мл спирта этилового 96%, количественно переносят при помощи 10 мл спирта этилового 96% в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем раствора спиртом этиловым 96% до метки.
[5 мл анализируемого раствора помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора 96% спиртом до метки, перемешивают.] (при необходимости!) (*)
Измеряют оптическую плотность раствора при длине волны 272 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм, используя в качестве раствора сравнения спирт этиловый 96%.
Содержание производных кумарина в абсолютно сухом сырье в пересчете на СО в процентах вычисляют по формуле:
|
734 . 20 . m . [5] . (100 - W)
где D - оптическая плотность испытуемого раствора при длине волны 272 нм;
734 – удельный показатель поглощения СО кумарина при длине волны 272 нм;
m – масса навески сырья, в граммах;
W – потеря в массе при высушивании сырья, в процентах.
Метод 2. Около 1 г измельченного сырья (точная навеска) помещают в колбу вместимостью 100 мл (или в аппарат Сокслета), и экстрагируют 50 мл хлороформа (петролейного эфира; 50% водного ацетона) в течение 3 часов.
Извлечение фильтруют, концентрируют до объема 2-3 мл, отбирают 0.1 мл (25 мкг) и наносят на хроматографическую пластинку Silufol UV254 размером 15х15 см.
Хроматографируют восходящим способом в системе петролейный эфир – этилацетат 2:1 (н-гептан – бензол 4:1).
Когда фронт растворителя дойдет до края пластинки, ее вынимают из камеры, сушат на воздухе до исчезновения паров растворителей, просматривают в УФ-свете, вырезают пятна фиолетового свечения и чистого слоя.
* При наличии СО кумаринов, их хроматографируют в тех же условиях, на той же пластинке и вырезают пятна на уровне веществ-стандартов.
Вырезанные пятна и зону чистого сорбента помещают в колбы вместимостью 50 мл, заливают 20 мл спирта этилового 95% и элюируют в термостате при температуре 50-600С в течение 3 часов. После охлаждения, элюаты фильтруют и определяют оптическую плотность в кювете с толщиной слоя 10 мм при длине волны 246 нм для псоралена, изопсоралена, 298 нм для псоберана, 311 нм для бергаптена, 313 – для изопимпинеллина.
В качестве раствора сравнения используют элюат чистого кусочка хроматограммы (или раствор СО в спирте этиловом 95%).
Содержание кумаринов в сырье вычисляют по формуле:
|
D0 . [E] . V2 . m . (100 - W)
где D1– оптическая плотность элюата при длине волны 246 (298, 311 или 313) нм;
D0 - оптическая плотность раствора СО при соответству-ющей длине волны;
или E – удельный коэффициент поглощения изопимпинеллина – 518 при длине волны 313 нм, бергаптена – 651 при длине волны 311 нм, псоралена 0,00005 г при длине волны 246 нм;
V1 – объем извлечения, в миллилитрах;
V2 – объем извлечения, нанесенного на хроматограмму, в миллилитрах;
V3 – объем элюата, в миллилитрах;
m – масса навески сырья, в граммах;
W – потеря в массе при высушивании сырья, в процентах.
Примечания. Приготовление раствора стандарт-ного образца псоралена.0.05 г (точная навеска) СО псоралена растворяют при встряхивании в спирте этиловом 95% в мерной колбе вместимостью 100 мл, доводят объем раствора спиртом этиловым 95% до метки, перемешивают (раствор А). 0.5 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора спиртом этиловым 95% до метки (раствор Б). Растворы хранят в темном месте в колбах с притертыми пробками. Срок хранения растворов - 6 месяцев.
1 мл полученного раствора содержит 0.00005 г псоралена (или другого СО).
В препаратах (настойки, отвары, экстракты) содержание кумаринов можно определять по методу 3.
Метод 3. 50 мл препарата фильтруют через бумажный фильтр, отбрасывая первые порции фильтрата. 20 мл фильтрата помещают в делительную воронку вместимостью 100 мл, прибавляют 20 мл хлороформа, 1 г натрия хлорида и экстрагируют в течение 5 мин. После разделения слоев хлороформное извлечение сливают в химический стакан. Процедуру извлечения хлороформом повторяют еще дважды порциями по 20 мл, экстракты объединяют. Водное извлечение оставляют для определения подлинности. Хлороформное извлечение упаривают на кипящей водяной бане досуха.
Сухой остаток растворяют в 10 мл спирта этилового 96%, количественно переносят при помощи 10 мл спирта этилового 96% в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96% и перемешивают.
[5 мл анализируемого раствора помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора спиртом этиловым 96% до метки и перемешивают.] (при необходимости!)
Измеряют оптическую плотность полученного раствора при длине волны 272 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм, используя в качестве раствора сравнения спирт этиловый 96%.
Содержание суммы производных кумарина в препарате, в пересчете на кумарин, в процентах (Х) вычисляют по формуле:
|
734 . 20 . [5]
где D - оптическая плотность испытуемого раствора препарата при длине волны 272 нм;
734 – удельный показатель поглощения СО кумарина при длине волны 272 нм.