Приложение 2. Качественный ТСХ-анализ наличия преднизолона метасульфобензоата натрия в лекарственном препарате
Таблица 1
| Стероиды | L0, мм | L, мм | Rf |
| тестостерон | 7,8 | 2,1 | 0,269 |
| андростен-3,17-дион | 3,8 | 0,487 | |
| холестерин | 1,6 | 0,205 | |
| эстрон | 4,5 | 0,577 | |
| 17α‑гидроксипрогестерон | 4,6 | 0,589 | |
| прегненолон | 3,2 | 0,410 | |
| β-ситостерин | 4,4 | 0,564 | |
| 4-холестен-3-он | 6,1 | 0,782 | |
| эргостерин | 5,7 | 0,731 |
Рис. 3.Вид пластинки ТСХ Рис. 4.Вид пластинки ТСХ
после ее обработки 40 % после ее обработки 0,25 %
серной кислотой (стероиды). раствором нингидрина в ацетоне(АК).
Формулы некоторых используемых в работе веществ и их некоторые свойства
Рис. 5. Структуры некоторых используемых в работе аминокислот и общая схема реакции аминокислот с нингидрином.
Таблица 2
| АК | L0, мм | L, мм | Rf |
| - | 9,0 | - | - |
| Asn | 1,1 | 0,122 | |
| L-Leu | 4,0 | 0,444 | |
| DL-Met | - | - | |
| Gly | 1,5 | 0,167 | |
| A | - | - | |
| B | - | - | |
| C | - | - | |
| - | - | - |
Выводы:в ходе лабораторной работы ознакомились с техникой разделения и анализа веществ с помощью ТСХ; осуществили определение качественных составов смесей стероидов и аминокислот в растворах методом ТСХ и определили параметры Rf (“относительно фронта”) для всех разделяемых соединений.
Приложение 1. ТСХ-анализ аминокислот и содержащих их экстрактов из лекарственных средств (таблетки метионина или глицина) с использованием их предварительного превращения во флуоресцентные НБД-производные
НБД-хлорид (НБД-Cl, NBD-Cl, 4-хлоро-7-нитро-2,1,3-бензоксадиазол) является нефлуоресцентным соединением, используемым как реагент для получения флуоресцентных производных соединений, содержащих амино- (первичные или вторичные, но не третичные или четвертичные) и тиогруппы, в т.ч. аминокислот. Такие производные аминокислот будут характеризоваться максимумами возбуждения флуоресценции (практически точно соответствует максимуму поглощения) и эмиссии флуоресценции при 470 нм (желтый цвет) и 530 нм (флуоресцирует желто-зеленым светом) (схема П1).
Схема П1. Реакция получения НБД-производных аминокислот.
1 – НБД-хлорид, 2 – анион аминокислоты, 3 – флуоресцнтное НБД-производное аминокислоты.
Такая модификация предоставляет возможности для чувствительного (по данным литературы до 100 фмоль) и селективного (вследствие специфичности параметров флуоресценции) определения аминокислот. Сами по себе аминокислоты (кроме триптофана и тирозина) сложно анализировать спектральными методами вследствие того, что они характеризуются небольшими коэффициентами экстинкции (практически не поглощают свет) во всем диапазоне спектра.
Методика выполнения задания:
К раствору анализируемой аминокислоты с pH в диапазоне 8-9 (проверить по лакмусовой бумажке и при необходимости довести pH до требуемого путем добавления к раствору аминокислоты насыщенного раствора NaHCO3) добавить 40 мМ раствор НБД-Cl в ацетонитриле (спросить у преподавателя). Полученную смесь перемешивают и оставляют в защищенном от прямого света месте на 15-20 мин. О протекании реакции свидетельствует изменение цвета раствора. По истечение данного времени аликвоту такой смеси наносят на пластинку ТСХ и проводят разделение как указано выше с использованием двух элюэнтов: а) бензол : ацетон 4:1 и б) тоже, с добавкой уксусной кислоты до 1%. Перемещение желтых и флуоресцирующих в свете лампы с максимумом 365 нм веществ фиксируют и делают вывод о изменение подвижности при добавлении уксусной кислоты.
Выводы:
Приложение 2. Качественный ТСХ-анализ наличия преднизолона метасульфобензоата натрия в лекарственном препарате
Преднизолон (рисунок П2-1, Б) является производным природного глюкокортикоидного гормона гидрокортизона (рисунок П2-1, А) и используется как основа (действующее вещество) глюкокортикоидных (стероидное) противовоспалительных и иммунодепрессивных препаратов.
А Б
Рисунок П2-1. Структуры гидрокортизона (А) и преднизолона (Б).
Такое производное характеризуется большим сродством к глюкокортикоидным рецепторам и менее подвержено биодеградации (инактивации) ферментными системами организма по сравнению с природным гормоном. Поскольку резкое временное повышение уровня активных форм стероидных гормонов (особенно при их приеме внутрь или инъекционно) увеличивает суммарные побочные эффекты этих лекарств и, за редким исключением (противошоковая терапия) не является необходимым для терапии в ряде лекарственных препаратов глюкокортикостероиды изначально присутствуют в виде сложных эфиров (про-лекарственная форма). Такие эфиры в организме постепенно гидролизуются с высвобождением активного глюкокортикоида. Так, в частности, преднизолон в ряде препаратов используется в виде эфира с натриевой солью мета-сульфобензойной кислоты (рисунок П2-2).
Рисунок П2-2. Структура преднизолона метасульфобензоата натрия.
Методика выполнения задания:
Одну таблетку препарата Солупред, содержащую номинально 20 мг преднизолона в виде преднизолона метасульфобензоата натрия, измельчить в ступке или в бумаге. Измельченный порошок перенести в пенициллинку или пробирку в которую добавить 2 мл этанола. Полученную взвесь перемешать и дать отстояться 10 мин (или отцентрифугировать 3000 обм, 5 мин). Аликвоту верхней фракции (~100-300 мкл) перенсти в другую пенициллинку и смешать с 100 мкл водного раствора щелочи 0,5 М, и выдержать 10 мин. при перемешивании. После этих операций на заранее подготовленную пластинку наносят (3-5 касаний) обработанную соляной кислотой экстракт, необработанный экстракт и стандарт гидрокортизона и затем проводят разделение и визуализацию результатов как описано выше для 3-кето-4-ен стероидов. Определяют Rf для детектируемых веществ и делают вывод о протекающих процессах.
Таблица 3
| Наименование | L0, мм | L, мм | Rf |
| гидрокортизон | 8,8 | 1,1 | 0,125 |
| преднизолон | 1,0 | 0,114 | |
| Gly | 2,3 | 0,261 | |
| Met | 7,5 | 0,852 |
Рис. 6.Вид пластинки ТСХ
после ее обработки 40 %
серной кислотой.
Выводы: