Техника приготовления гистологических препаратов

Приготовление гистологических препаратов включает в себя несколько этапов: взятие материала, фиксация, обезвоживание, промывка, уплотнение, нарезание препарата, окрашивание, просветление и заключение срезов.

Взятие материала

Хороший гистологический препарат должен отвечать таким требованиям:

- исследуемая ткань должна в максимальной степени сохранить свое прижизненное строение,

- срез должен быть тонким и прозрачным, чтобы через него проходил свет,

- изучаемые микроструктуры должны быть хорошо видны.

Для этого нужно обеспечить:

- своевременное взятие и надлежащую фиксацию исследуемого материала,

- качественное приготовление и обработку срезов,

- соответствующую окраску изучаемого препарата.

При микроскопическом исследовании тканей и органов большое значение имеет техника взятия материала. Поэтому при иссечении кусочков необходимо соблюдать следующие правила:

1. Объекты, подлежащие исследованию, должны быть свежими. Этому условию больше всего удовлетворяет материал, направленный прямо из операционной. Хуже обстоит дело с исследованием кусочков, взятых при вскрытии трупов, где приходится сталкиваться с посмертными изменениями.

2. Иссекая кусочки, нужно учитывать микроскопическое строение того или иного органа или ткани.

Например: кусочки из почки и надпочечника вырезают с таким расчетом, чтобы в них попали корковое, и мозговое вещество, для чего разрезы ведут перпендикулярно к поверхности указанных органов. Из органов, имеющих во всех своих частях одинаковое строение (печень, селезенка, щитовидная железа и др.) объекты можно иссекать как угодно, но желательно захватывать с капсулой. Стенки полых органов (мочевой пузырь, кишечник и др.) исследуют на поперечных сечениях.

3. Объекты из патологических и измененных тканей (опухоли, язвы) вырезают на границе с нормальными частями таким образом, чтобы были захвачены нормальные и измененные участки. При распространенном патологическом процессе рекомендуется брать несколько кусочков: одни из наиболее пораженных отделов, другие - по границе с нормальной тканью.

4. Иссечение необходимо производить острыми инструментами, чтобы не травмировать ткани.

5. Недопустимо никакое сдавливание кусочков, а также очистка поверхности органа (например: слизистой оболочки, серозного покрова) пальцами, инструментами, тряпками.

6. Кусочки переносят в фиксирующую жидкость на лезвии ножа или пользуются анатомическими пинцетами.

Краткие замечания об артефактах при иссечении и

Фиксации материала

Хорошо известно, что плохая фиксация и механическая травматизация тканей (плохое качество режущих инструментов, раннее вскрытие, недостаточный опыт вскрывающего) постоянно сопровождаются появлением темных клеток в различных тканях и органах и особенно в нервной системе, где практически они имеют первостепенное значение. Важнейшими морфологическими формами такого рода искусственных образований являются: гиперхромные и сморщенные нейроны, пикнотические ядра, пузырьковидное превращение клеточного тела. Появление последних обычно связано с фиксацией ткани мозга в недостаточно крепких спиртах и обмыванием объектов водой.

Принимая во внимание сохранение раздражимости нервных клеток спустя некоторое время после наступления смерти организма, не следует слишком торопиться со вскрытием и извлечением мозга. И то, и другое следует делать тогда, когда целиком или в значительной мере исчезнет раздражимость нервов, а аутолитические процессы будут минимальными, примерно в пределах 0,5 - 1 часа. И даже в этом последнем случае не снимается требование высокой осторожности при извлечении и иссечении материала. Уже в 1892 г. Ван-Гизон отметил, что наиболее частой причиной артефактов в нервной системе является повреждение мозга во время вскрытия.

Для возникновения артефактов весьма велико значение неудовлетворительной фиксации. Ещё в 1926 году ученые впервые установили, что фиксатор действует неодинаково на разной глубине объекта. Возникающие в процессе спиртовой фиксации диффузионные токи могут вести к смещению ядерного и клеточного содержимого и даже к разрывам. Общеизвестно, что позднее вскрытие, фиксация мозга в виде отдельных излишне толстых кусков, а также недостаточное количество фиксатора ведут к аутолитическим процессам в глубоких слоях объектов. При благоприятных условиях внешней среды (высокая температура, влажность) эти изменения в нервной системе развиваются очень быстро и морфологически ощутимы уже через несколько часов после смерти, проявляясь в картинах побледнения и распыления хроматофильного вещества.

Говоря об артефактах, нельзя не напомнить и о таком моменте, как необходимость соблюдения принципа стандартности при заборе и последующей обработке экспериментального и контрольного материала, ибо только так возможно гарантировать более или менее правильную оценку результатов микроскопического исследования. Впрочем, и при этих условиях нередко возникают серьезные трудности. Дело в том, что артефакты контрольного и экспериментального материала могут быть далеко не одинаковы, поскольку в одном случае механической травматизации и грубой фиксации подвергаются нормальные нервные элементы, а в другом – патологически измененные. Вот почему нельзя полностью согласиться с таким довольно распространенным представлением, что будто бы тщательное сопоставление опытного и контрольного материала позволяет не учитывать артефакты фиксации при экспериментальных и патологоанатомических исследованиях. В таких случаях, наряду с сопоставлением опытного и контрольного материала, может оказаться полезным и метод фиксации путем перфузии. Этот последний метод является существенным дополнением к методу фиксации в виде отдельных кусков, поскольку он в значительной мере защищает от возникновения артефактах по причине механической травматизации материала.

Постоянными артефактами в центральной нервной системе являются периваскулярные и перицеллюлярные щели. Наблюдаемые на любых срезах они нередко дают повод для ошибочной диагностики отека.

Могут быть и другие структурные нарушения искусственной природы, как, например, пустоты (округлой и неправильной формы) и щели в цитоплазме и ядрах нервных клеток.

Нельзя еще раз не напомнить о необходимости соблюдения очень большой осторожности при оценке картин хроматолиза со стороны отдельных ганглиозных клеток или их групп. Подобные картины могут быть выражением не только функционального состояния или каких-то вредных воздействий (экспериментального или спонтанного характера), но и возникать, как уже было отмечено выше, в результате неудовлетворительной фиксации материала.

В заключение следует упомянуть об агональных изменениях нейронов, поскольку они могут быть сходны с артефактами при неудовлетворительной фиксации. Речь идет о периваскулярных некробиозах с побледнением и исчезновением ганглиозных клеток и вакуольных изменениях их клеточных тел, возникающих при длительнойагонии.

Фиксация

Первым этапом в обработке кусочков, вырезанных их различных органов и тканей для микроскопического исследования, является фиксация. Она имеет целью закрепление тканевых структур в том состоянии, в каком они находились в момент погружения кусочков в фиксирующую жидкость, и предохранение их от дальнейшего разрушения. Нужно остановить происходящие в ткани посмертные процессы (прежде всего ферментативные), сохранив при этом ее прижизненное строение. Извлеченные из организма ткани очень быстро подвергаются аутолизу. Необходимо остановить эти процессы, коагулировать белки и инактивировать ферменты. Для этого используется фиксация материала, а растворы, употребляемые с этой целью, называются фиксаторы.

При работе с фиксирующими жидкостями необходимо соблюдать некоторые правила. Общие правила фиксации:

- фиксацию проводят при комнатной температуре (18-20ОС).

- недопустимо обмывание кусочков водой перед погружением их в фиксирующую среду.

- если фиксирующая жидкость после погружения кусочков мутнеет или изменяет свой цвет (окрашивает кровью), то её немедленно меняют.

- объем фиксирующей жидкости должен не менее чем в 20 раз превышать объем фиксируемых кусочков ткани.

- фиксатор должен со всех сторон прилегать к кусочку ткани, поэтому на дно сосуда кладут вату или фильтровальную бумагу или кусочек ткани подвешивают на нитке.

- продолжительность фиксации зависит от свойств фиксатора, от скорости его проникновения в ткани.

- материал, взятый из трупа или иссеченный на операции, подлежит немедленному помещению в заранее приготовленную фиксирующую жидкость, так как промедление с фиксацией может отразиться на результатах микроскопического исследования.

Фиксаторы могут быть простыми (формальдегид, этиловый спирт, метанол) и сложные (жидкость Мюллера, жидкость Ценкера, жидкость Буэна, жидкость Карнуа).

Химические фиксаторы либо способствуют образованию в белках поперечных связей, либо вызывают денатурацию и осаждение белков, замещая связанную с ними воду. В результате ткани уплотняются и становятся тверже. Кроме того, большинство фиксаторов инактивирует содержащиеся в клетке ферменты. Большинство фиксаторов обладает также хорошими антисептическими свойствами, убивая бактерий и другие болезнетворные агенты, иногда содержащиеся в тканях и могущие представлять опасность для здоровья исследующих их людей.

Все фиксирующие средства делятся на простые и сложные в зависимости от того, входит ли в их состав одно какое-нибудь веществ или несколько.