Проведение окрашивания

При окраске водными красителями срезы переносят из дистиллированной воды, а при окраске спиртовыми – из спирта соответствующей концентрации, непосредственно в красящий раствор (прямое окрашивание) или сначала в жидкость для протравки (непрямое окрашивание). Когда препарат приобретает

нужную интенсивность окраски, его промывают в воде (или спирте) для удаления избытка красителя, а затем, если нужно, дифференцируют в соответствующей жидкости. Излишний краситель отмывают до тех пор, пока он не перестает переходить из среза в отмывающую жидкость.

Окрашивание срезов, наклеенных на стекло, проводят путем помещения их в красящий раствор. Для этого специальные кюветы, позволяющие красить одновременно большое количество стекол, проводят по схеме в высоких стаканчиках с краской.

Для того чтобы окрашенный препарат можно было исследовать в проходящем свете и дольше хранить, он должен быть прозрачным и защищен от высыхания, загрязнения и повреждения.

Все эти условия обеспечивают просветлением и заключением препарата в специальные срезы.

Просветление н заключение срезов

Просветление делает препараты прозрачными, проходимыми для лучей света и потому удобными для исследования. Различают две группы просветляющих веществ в зависимости от того, способны ли они просветлять срезы после извлечения их из воды или только после обезвоживания спиртом.

Первую группу веществ, т. е. просветляющих срезы после воды, составляет глицерин, глицерин-желатина и т. д. и ряд сложных специально приготовленных сред, как то: фаррактова жидкость, масса Апатии. Подобные просветляющие вещества обычно употребляют при некоторых специальных методах исследования, например на липиды, амилоиды. В этом случае окрашенный срез извлекают из воды на предметное стекло, расправляют, удаляют избыток воды вокруг среза тряпкой, кладут каплю глицерина или другое просветляющее вещество из этой группы и покрывают покровным стеклом. Можно применять этот метод и для различных ориентировочных исследований.

Ко второй группе веществ (просветляющих срезы после спирта) относятся ксилол, толуол, эфирные масла, карболксилол, карболтолуол и т. д.

Для просветления срезов чаще всего пользуются веществами второй категории, так как они обладают более высоким просветляющим эффектом и дают прочные препараты. По этой последней причине срезы после окрашивания подвергают спиртовой обработке, то более, то менее тщательной смотря по тому, с каким просветляющим средством приходится работать.

Так, например, ксилол и толуол весьма чувствительны к качеству обезвоживания срезов и поэтому здесь показано применение абсолютного спирта. Креозот, эфирные масла, карболксилол в этом отношении менее чувствительны, они легко просветляют и после 960 спирта. Все просветляющие вещества обладают теми или иными неблагоприятными свойствами, проявляющимися иногда при длительном хранении препаратов. Один из них вызывает пожелтение препаратов (креозот), другие сильно морщат срезы (ксилол, толуол, карболксилол) и, наконец, почти все они, за исключением ксилола и толуола, в той или иной степени извлекают различные синтетические (анилиновые) красители и поэтому имеют ограничения.

На основании вышеизложенного, делаем вывод, что большим достоинством ксилола и толуола является их абсолютно индифферентность к любым красителям.

В практической работе при простых окрасках (гематоксилин-эозин, по Ван-Гизону) и многих специальных методах исследования для целей просветления удобнее всего пользоваться комбинацией просветляющих средств, т. е. просветлять срез вначале веществом, не требующим абсолютного спирта (эфирное масло, креозот, карболксилол), а затем быстро в течение 1 минуты, обрабатывать ксилолом, применяя его повторно. В просветляющем веществе срез держат до тех пор, пока он не станет совсем прозрачным. На черном фоне стола непросветленные участки среза представляют в виде беловатых пятен. Эта операция занимает от 15-20 секунд до нескольких минут. Быстрота просветления препарата зависит от крепости употреблявшегося спирта и тщательности обработки им. При неудовлетворительной спиртовой обработке, а также для более скорого просветления показано повторное применение просветляющего вещества, которое в этом случае часто комбинируют с быстрым просушиванием среза втрое или вчетверо сложенной фильтровальной бумагой.

Просветленные и обработанные ксилолом срезы заключают в специальные срезы.

Для заключения гистологических срезов используют такие вещества, как канадский и пихтовый бальзамы, канифоль, гумми - сироп, глицерин и др. Одни из них являются веществами дефицитными, другие обладают существенными недостатками.

Применение пластических масс для заключения гистологических срезов позволяет отказаться от всех перечисленных выше веществ и от покровных стекол, т. к. пластмасса пропитывает срез и одновременно покрывает его тонким слоем сверху, заменяя тем самым покровное стекло.

Полистирол

Полистирол представляет собой пластическую массу, растворимую в ксилоле, бензоле, толуоле и потому пригодную для заключения срезов, окрашенных гематоксилин - эозином, по Ван-Гизону и т. п. С завода полистирол получают в виде отдельных, твердых, прозрачных кусочков.

Для заключения гистологических срезов следует пользоваться 30% раствором полистирола в ксилоле (толуоле), который имеет консистенцию густого меда и совершенно прозрачен. Хранить его надо в банке с притертой пробкой во избежание испарения ксилола и загустения раствора. Если последний со временем станет слишком густым, к нему добавляют ксилол, если же раствор окажется жидким, нужно дать возможность улетучится части растворителя. При нанесении раствора полистирола на стекло черезминут образуется прозрачная прочная пленка. В быстроте образования пленки состоит большое преимущество полистирола: однако пленка обладает существенными недостатками: она хрупкая, ломкая и плохо прилегает к стеклу. Для устранения этих недостатков к раствору полистирола необходимо добавить так называемый пластификатор - вещество, придающее эластичность и гибкость полистироловой пленке, а также значительно увеличивающее её способность прилипать к стеклу. В качестве пластификатора следует применять дибутилсебацинат.

Дибутилсебацинат представляет собой бесцветную маслянистую жидкость, которая при обычной температуре практически не испаряется и придает эластичность и гибкость полистироловой пленке и очень долгое время. В готовый раствор полистирола следует добавить пластификатор в таком количестве, чтобы раствор последнего в полистироле был равен 6% (т. е. на 100 мл раствора полистирола добавляется 6 мл пластификатора). Скорость образования пленки при добавлении пластификатора почти не изменяется (она образуется через 40-60 минут), однако пленка получается эластичной, не трескается, не ломается и плотно прилегает к предметному стеклу.

Методика заключения срезов в полистирол: рез, извлеченный на предметное стекло из карболксилола, покрывается несколькими каплями раствора полистирола. Наносить раствор можно стеклянной палочкой из маленькой бутылочки, куда предварительно наливается небольшое количество полистирола из основного запаса раствора и равномерно распределяется по стеклу. Пока не образовалась прочная сухая пленка, срез следует предохранять от попадания пыли.

После данных процедур препарата можно исследовать под световым микроскопом. Помещенные под стекло срезы для светового микроскопа могут долго хранится и многократно использовать.

Заключение

Гистологическое исследование аутопсийного, биопсийного материала, а также органов тканей, удаленных при хирургических операциях ставит перед собой цель определения характера патологического процесса. Значение этого метода исследования трудно переоценить, так как он позволяет уточнить диагноз, определить морфологические особенности патологического процесса. На основании полученных данных врач имеет возможность избрать наиболее правильную тактику лечения больного. Особенно важное значение имеет биопсия при определении опухолей, когда малейшая невнимательность и неточность могут послужить причиной роковой ошибки. При работе с биопсийным материалом от лаборанта-гистолога требуется предельная собранность и четкость.

Общие принципы и методы окрашивания гистологических препаратов

В основе окрашивания клеток и тканей лежат физико-химические процессы (диффузия, адсорбция, абсорбция, растворимость и др.), происходящие как в красителе, так и в микроструктурах. Большое значение имеют плотность ткани и дисперсность красителя, которые определяют последовательность и скорость окрашивания.

Целью окрашивания является более отчетливое выявление различных компонентов клеток и тканей. Некоторые красители обеспечивают этот эффект, растворяясь в выявляемых компонентах, например нейтральных жирах. Другие красители вызывают химическую реакцию, например выявление железа с образованием берлинской лазури в кислой среде. Во многих случаях процесс окрашивания возможен только при наличии протравы, например гематоксилин окрашивает ткань в присутствии солей металлов.

В гистологической практике применяют основные, кислотные и нейтральные красители. Основные, или ядерные, красители — это основания или их соли, которые окрашивают структуры кислой природы (хроматин ядер, ядрышко и др.) и называются базофильными. К ним относятся гематоксилин, тионин, кармин, метиловый зеленый и др. Кислотные красители — это кислоты или их соли, с помощью которых выявляют вещества и структуры основной природы (цитоплазматические структуры клеток, эритроциты и т.д.). Таковыми являются эозин, кислый фуксин, Конго красный (конгорот), эритрозин. Нейтральные красители: судан III, судан IV, метиленовый синий. Процесс гистологического окрашивания условно подразделяют на прогрессивный и регрессивный, прямой и непрямой, простой и сложный. При прогрессивном типе окрашивания процесс идет до тех пор, пока не достигается интенсивное проникновение красителя в ткань. Регрессивный тип основан на первоначальном перекрашивании структур с последующей дифференцировкой до нужного уровня. Если раствор красителя непосредственно действует на ткань, то говорят о прямом окрашивании. Окрашивание после предварительной подготовки ткани (протравливания) называется непрямым. Окрашивание одним красителем - простое, а при использовании нескольких красителей — сложное.

Для получения оптимальных результатов окрашивания гистологических препаратов нужно использовать растворы, приготовленные в точном соответствии с рекомендуемой прописью. Перед приготовлением нужно внимательно осмотреть реактивы, так как возможны изменение цвета, окисление, кристаллизация и т.п. По мере инактивации, разбавления и изменения концентрации растворов красителя при длительном использовании его необходимо своевременно заменять свежим. Для хранения красителей и проведения окраски применяют химически чистую маркированную посуду. После приготовления новых порций красителя, особенно при использовании различных партий реактивов окраску нужно контролировать под микроскопом. Продолжительность окрашивания реактивами различных фирм варьирует.

Ацидофилия

Ацидофилия (от лат. acidus — кислый и греч. phileo — люблю)

(биол.), способность клеточных структур окрашиваться кислыми красителями: эозином, кислым фуксином, пикриновой кислотой и др. Такие структуры называются оксифильными, эозинофильными, фуксинофильными и т. д. Причина А. заключается главным образом в основных (щелочных) свойствах окрашивающихся элементов. А. используется для различения клеточных структур, например при анализе клеток крови. Ср. Базофилия.

Базофилия

(от др.-греч. βάσις основание и φιλία — дружба, любовь, склонность) — химическое сродство коснованиям, в том числе, к осно́вным красителям. Базофилией в гистологии называют способностьклеточных структур окрашиваться основными (щелочными) красителями (азуром, пиронином,гематоксилином и др.), обусловленная кислотными свойствами окрашивающихся компонентов клетки,главным образом нуклеиновых кислот (ДНК и РНК). Повышение базофилии клетки обычно свидетельствует опроисходящем в ней интенсивном белковом синтезе. Базофилия свойственна растущим, регенерирующим,опухолевым тканям. Используется для различения клеток крови (см. базофилы), анализа клеток переднейдоли гипофиза, островковой ткани поджелудочной железы и.т.д.

Нейтрофилия

Нейтрофильные гранулоциты или нейтрофилы, сегментоядерные нейтрофилы, нейтрофильные лейкоциты — подвид гранулоцитарных лейкоцитов, названный нейтрофилами за то, что при окраске по Романовскому они интенсивно окрашиваются как кислым красителем эозином, так и основными красителями, в отличие от эозинофилов, окрашиваемых только эозином, и от базофилов, окрашиваемых только основными красителями.