Распространение микробов в природе

Микробы широко распространены в природе, используя для своего питания различные органические и даже минеральные вещества. Важными факторами, обеспечивающими широкое распространение микроорганизмов во внешней среде, являются их высокая скорость размножения, значительная устойчивость к неблагоприятным факторам внешней среды и высокая приспособляемость к меняющимся условиям обитания. Почва, вода и воздух могут служить источником микробного загрязнения продуктов питания, лекарственного сырья и препаратов, про­изводственных помещений аптек, а также источником заражения людей патогенными микроорганизмами. Как правило, представители нормальной микрофлоры почвы, воды и воздуха не являются патогенными для человека. Основными путями попадания патогенных микроорганизмов от больных людей и носителей микробов в окружающую среду являются фекальный и воздушно-капельный.

Точное количественное определение бактерий (в том числе болезнетворных) в воде и других объектах внешней среды (почва, пищевые продукты, лекарственные препараты и др.) представляет значительные трудности в связи с невозможностью создания оптимальных условия для размножения всех встречающихся в исследуемом материале микроорганизмов, а также из-за различий их биологических свойств, низкой концентрацией, временным пребыванием и трудоемкостью исследований. Поэтому о загрязненности внешней среды выделениями человека судят по обнаружению в ней санитарно-показательных микроорганизмов. Эти микробы являются постоянными представителями нормальной микрофлоры организма человека и теплокровных животных, не находятся в других природных резервуарах или не имеют других естественных мест обитания. Санитарно-показательные микроорганизмы сохраняются жизнеспособными в окружающей среде в течение времени, сравнимого со сроками выживания отдельных видов патогенных бактерий, выделяющихся из организма теми же путями, они не способны интенсивно размножаться в окружающей среде и их количество остается постоянным определенный период времени после попадания в окружающую среду. Виды санитарно-показательных микроорганизмы, их количество и биологические свойства доступны для определения с помощью классических микробиологических методов.

Санитарно-показательными микроорганизмами для воды являются Е. coli, S. faecalis; для почвы - Е. coli, S. faecalis, С. perfringens; для воздуха - S. haemolyticus, S. viridans, S. aureus; для предметов обихода - E. coli, S. faecalis, S. аureus. Показателями фекального загрязнения среды служат E.coli, S.faecalis, C.perfringens; показателями орально-капельного загрязнения— S. viridans, S. haemolyticus и S. aureus. Сроки выживания в объектах окружающей среды Е. coli совпадают со сроками выживания патогенных кишечных бактерий. С. perfringens присутствуют в окружающей среде наиболее длительно. Присутствие S. faecalis является показателем свежей фекальной загрязненности. Если С. регfringens обнаруживается без Е. coli, то это свидетельствует о старом фекальном загрязнении среды.

Количественные характеристики микробной загрязненности почвы, воды и других объектов оцениваются по данным определения коли- и перфрингенс-индекса - количества клеток кишечной палочки или С. perfringens в 1 л воды или 1 г почвы.

Микрофлора почвы. Почва, содержащая различные органические соединения, является благоприятной средой для существования многих видов микроорганизмов и главным резервуаром микробов в природе. Из почвы микробы попадают в воду, воздух, на поверх­ность растений, других объектов внешней среды.

В почве содержатся многочисленные виды непатогенных бактерий, актиномицетов, грибов и простейших, а также некоторые болезнетворные микробы (например, палочка газовой гангрены, столбняка, сибирской язвы и др.).

Санитарно-бактериологический анализ почвывключает определение микробного числа и содержания санитарно-показательных микроорганизмов почвы.

Микробное число почвы — это общее количество микроорганизмов, содержащихся в 1 г почвы. Для его определения, пробы почвы, взятые в асептических условиях, измельчают, растирают и готовят десятикратные разведения (от 1:100 до 1:100 000). Посев выполняют либо в глубину питательного агара (1 мл соответствующего разведения вносят в стерильную чашку Петри и заливают 10 мл расплавленного и охлажденного до 45⁰С МПА или сусло-агара), либо на поверхность питательного агара (0,1 мл соответствующего разведения суспензии распределяют шпателем по поверхности МПА или сусло-агара в чашке Петри). Чашки с сусло-агаром помещают в термостат при 24⁰С (для выявления грибов), чашки с МПА при 37⁰С (для выявления бактерий), инку­бируют 48 ч, после чего подсчитывают количество выросших колоний для каждого разведения почвы, вычисляя затем средний показатель микробного числа почвы.

Для определения коли-индекса почвы используют элективные питательные среды, например, жидкую среду Кесслера, содержащую пептон и лактозу (сбраживается кишечной палочкой с образованием кислоты и газа), а также желчь и краситель генциановый фиолетовый, которые подавляют рост многих почвенных микроорганизмов, но не препятствуют росту кишечной палочки. Для улавливания газа, образовавшегося в результате расщепления лактозы, служат специальные стеклянные «поплавки». После суточной инкубации посевов почвы на среде Кесслера отбирают положительные пробы, характеризующие рост Е.coli в виде диффузного роста и образования газа, скапливающегося в «поплавке». Из этих проб делают высевы на среду Эндо, инкубируют их при 37⁰С 24 ч, отмечая характерные для Е. coli темно-красные колонии с металлическим блеском, из которых готовят мазки и при наличии в них грамотрицательных палочек делают вывод о присутствии Е. coli.

Перфрингенс-титр почвы – наименьшее ее количество в граммах, в котором содержится одна жизнеспособная клетка Cl. perfringens, определяется на железо-сульфитном агаре (среда Вильсона — Блера). Посев почвы производят из дестикратных разведений почвенной суспензии, прогретых при 80⁰ С 10—15 мин с целью инактивации вегетативных форм бактерий. Затем из соответствующих разведений берут стерильной пипеткой по 1 мл суспензии и вносят в пробирку с расплавленной средой Вильсона-Блера. Посев помещают в термостат при 37-43⁰ С. При наличии в пробе Cl. perfringens через 3-18 часов образуется сульфид железа (FeS), окрашивающий колонии этого микроорганизма в черный цвет. При ферментации глюкозы образуются газы, разрывающие среду. Можно использовать также молочные среды, на которых Cl. perfringens энергично сбраживает лактозу, в результате этого молоко быстро (в течение 3—4 ч) створаживается в виде губчатого сгустка, а образующийся при этом газ разрывает сгустки казеина, вытесняя их в верхнюю часть пробирки. Наличие Cl. perfringens в средах подтверждается микроскопическим методом (в мазках, окрашенных по Граму, обнаруживают крупные грамположительные палочки с центрально расположенной спорой, которые могут располагаться цепочками).

Микрофлора воды.Вода открытых водоемовсодержит различное количество микроорганизмов в зависимости от содержания в ней органических веществ, глубины залегания водоносного слоя и характера грунта. Загрязнение воды открытых водоемов происходит сточными водами и с поверхности почвы, содержащими большое количество различных микробов, включая кишечную палочку. В воду могут попадать болезнетворные микробы, в частности, возбудители кишечных инфекций (брюшного тифа и паратифов, дизентерии, холеры и др.).

Санитарно-бактериологический анализ водыпроводится с цельюопределения микробного числа (общего количества мезофильных аэробных и факультативных анаэробных микроорганизмов) в 1 мл воды и содержания санитарно-показательных микроорганизмов.

Для определения микробного числа 1 мл воды вносят в 2 пустые стерильные чашки Петри, в которые наливают 10-12 мл расплавленного при температуре 45⁰С МПА в одну чашку и такое же количество сусло-агара во вторую, перемешивают и после застывания сред культивируют на МПА при 37⁰С 24 ч, а на сусло-агаре для выявления роста грибов 2—3 сут при температуре 24⁰С. Учитывают число колоний микроорганизмов, что соответствует микробному числу воды, которое для питьевой воды централизованного водоснабжения не должно превышать 50 микробных клеток в 1 мл.

В аптеках этим методом определяют микробное число дистиллированной воды, которое должно равняться 10-15. Пробы дистиллированной воды, используемой для приготовления лекарственных средств (кроме лекарств для инъекций и глазных капель), в объеме 300 мл отбирают из бюретки, конец которой обжигают ватой, смоченной спиртом, помещают в стерильные бутылки, закрываемых затем ватными пробками и бумажными колпачками. Пробы дистиллированной воды, используемой для приготовления инъекционных растворов и глазных капель, отбирают в стерильные флаконы в количестве 15—20 см³ (мл) из емкостей, в которых проводится стерилизация.

Определение кишечных палочек в воде (коли-индекс) проводят с использованием 2 методов - двухэтапного бродильного и метода мембранных фильтров.

Анализ воды с помощью двухэтапного бродильного метода проводят в трех параллельных рядах, начиная с 10; 1 и 0,1 мл. Для объемов 10 мл используют флаконы по 100 мл лактозо-пептонной среды, все остальные объемы воды вносят в пробир­ки с 5 мл питательной среды. Водопроводная вода исследуется в трех объемах по 100 мл воды, трех - по 10 мл воды и трех - по 1 мл. Культивирование посевов производят при 38⁰С в течение 24 ч. В случае отсутствия помутнения среды и образования газа через сутки дается отрицательный ответ. При наличии помутнения среды кислоты и газа из такого флакона производят посев на сектора чашки со средой Эндо. Если через 16-18 ч на среде вырастают темно-красные с металлическим блеском или колонии без блеска, из них готовят мазки и проводят пробу на оксидазу (снимают по 2-3 ко­лонии и наносят на фильтровальную бумагу, смоченную диметил-пара-фенилендиамином; кишечная палочка оксидазой не обладает, поэтому изменения цвета фильтровальной бумаги не происходит). Наличие в мазках грамотрицательных палочек и отсутствие оксидазы свидетельствует о положительном результате исследований, которые выражают в виде коли-индекса (количество кишечных палочек в 1 л воды). Для питьевой воды централизованного водоснабжения коли-индекс не должен быть больше трех.

Для определения коли-индекса воды методом мембранных фильтров фильтруют воду в объеме от 300 до 500 мл, помещая затем фильтр на поверхность среды Эндо. Чашки с фильтрами инкубируют при 37⁰С в течение 18-24 ч. Количество темно-красных колоний с металлическим блеском на фильтре, в которых при микроскопическом исследовании находят грамотрицательные палочки, соответствует коли-индексу при перерасчете показателя на 1 литр воды. Для водопроводной воды коли-индекс составляет 2.

Другим санитарно-показательным микроорганизмом, свидетельствующем о фекальном загрязнении воды, является энтерококк (Streptococcus faecalis). Индекс энтерококков в исследуемой воде определяют в параллельных рядах посевов в жидкой щелочно-полимиксиновой среде с 10-кратными разведениями в зависимости от предполагаемого бактериального загрязнения воды от 100 до 0,01 мл. Объемы воды по 100 и 10 мл вносят в щелочно-полимиксиновую среду двойной конце­нтрации, остальные объемы — в пробирки со средой обычной концентрации, учет производят после 24 ч инкубации при 37 °С по изменению цвета и помутнению среды. Из этих флаконов проводят высев на сектора чашки с молочно-ингибиторной средой. Фекальный стрептококк растет на секторах чашек в виде черных колоний с металлическим блеском.

Микрофлора воздуха.Воздух не является благоприятной средой для обитания микробов, попадающих в него из почвы, воды, организма человека и животных, существуя в нем ограниченный промежуток времени. В воздухе найдены сапрофитные спорообразующие бактерии, стафилококки, сарцины, споры грибов, а также некоторые патогенные виды микробов, выделяемые человеком через верхние дыхательные пути при воздушно-капельных инфекциях (грипп, респираторные инфекции, коклюш, дифтерия и др.).

Санитарно-бактериологическое исследование воздуха.Включает определение микробного числа воздуха и санитарно-показательных микроорганизмов.

Микробное число воздуха определяется обычно аспирационным методом с помощью аппарата Кротова (рис.33, см. приложение) со скоростью просасывания воздуха не менее 25 л/мин. В аппарате Кротова воздух засасывается через щель, ударяясь о поверхность питательной среды в чашке Петри. В качестве питательной среды для определения микробного числа пользуются мясо-пептонным агаром, а для определения санитарно-показательных микроорганизмов применяются специальные питательные среды (для выявления золотистого стафилококка - молочно-солевой или желточно-солевой агар и для обнаружения стрептококков - среда Гарро). Преимуществом этого метода является возможность посева определенного объема воздуха. Для определения общего числа бактерий количество пропущенного воздуха составляет 100 л, для выявления санитарно-показательных микроорганизмов (золотистого стафилококка), дрожжевых и плесневых грибов - 250 л. Для определения роста сапрофитных бактерий используют МПА, грибов - сусло-агар и агар Сабуро, золотистого стафилококка — желточно-солевой агар. В каждом помещении аптеки посев делают на 5-10 чашек Петри с МПА и желточно-солевым агаром. Посевы помещают в термостат при 37⁰С на 24 ч, после чего выдерживают 24 ч при комнатной температуре; посевы на среде Сабуро выращивают при 22—28⁰С 4 сут. Затем подсчитывают количество выросших колоний и производят пересчет на 1 м³ воздуха. Идентификацию золотистого стафилококка, выросшего на желточно-солевом агаре проводят по общепринятым тестам. Допустимые нормы микробного числа воздуха различных помещений аптеки представлены в табл. 6.

В последнее время для определения микрофлоры воздуха разработаны более совершенные приборы – импакторы (рис. 34, см. приложение).

В качестве ориентировочного метода оценки микрофлоры воздуха может использоваться седиментационный метод.

Для этого чашки Петри с плотной пита­тельной средой открывают в местах отбора проб воздуха, выдерживая в течение 5-30 мин, после чего чашки закрывают и помещают их в термостат. По количеству выросших колоний подсчитывают микробное число воздуха, пользуясь правилом Омелянского, в соответствии с которым считают, что на поверхность питательной среды площадью 100 см² в течение 5 мин оседает столько микроорганизмов, сколько их содержится в 10 л воздуха. Каждая микробная клетка дает начало одной колонии. Зная количество выросших колоний и время экспозиции, вычисляют количество микробов, содержащихся в 1 м³ (1000 л) воздуха.

Результаты определения микробной загрязненности воздуха различных помещений аптек представлены в таблице 6.

Согласно действующим санитарным правилам, микробиологическое исследование воздуха различных помещений аптек осуществляется работниками центров санитарно-эпидемиологического надзора не реже одного раза в квартал.

Анализ микробной загрязненности столов, оборудования, аптечной посуды, полотенец, халатов, рук персонала. Санитарно-бактериологическому анализу подвергаются смывы со столов, оборудования, полотенец, халатов и рук работников аптек (1 раз в месяц); растворы для инъекций, глазные капли до стерилизации, нестерильные лекарственные формы; аптечная посуда и пробки на общую микробную обсемененность (2 раза в квартал). Эти исследования направлены на проверку качества мытья посуды, соблюдения правил санитарного режима и приготовления лекарственных препаратов. Кроме определения микробного числа, исследуют состав микрофлоры на наличие Е. coli, энтерококков, энтеровирусов, S. aureus, синегнойной палочки и бактерий рода Proteus, а при необходимости - патогенных микроорганизмов.

Таблица 6. Показатели микробной обсемененности воздуха помещений аптек

Помещения	Показатели микробной загрязненности воздуха в 1 м3
	Микробное число	S.aureus	Плесневые и дрожжевые грибы
Асептический блок, стерилизационная	500	Не должно быть в 250 л воздуха
Ассистентская, фасовочная, дефекторная, материальная	750	Не должно быть в 250 л воздуха
Моечная (во время работы)		Не должно быть в 250 л воздуха	До 12
Зал обслуживания (во время работы)		До 100	До 20

Обозначения: числитель – показатель до работы, знаменатель – после работы

При проведении этих анализов используется 2 метода - тампонов и смывов.

Первый метод проводится с помощью стерильных ватных тампонов,погруженных в пробирки с 2 мл 0,1% пептонной воды или изотонического раствора хлорида натрия. Тампон не должен касаться поверхности жидкости и его смачивают непосредственно перед взятием проб.

Для отбора проб с поверх­ностей (например, столы) используют трафареты из проволоки или жести, которые предварительно стерилизуют обжиганием в пламени горелки; затем накладывают их на поверхность стола и производят смыв влажным тампоном (салфеткой) с поверхности 100 см², ограниченной трафаретом. Тампон помещают в пробирку, добавляют 8 мл жидкости и тщательно прополаскивают, отжимая тампон. Общую микробную загрязненность определяют путем посева 1 мл смыва в глубину расплавленного МПА в чашке Петри. Посевы выращивают сутки при 37°С, подсчитывают количество выросших колоний и определяют общую микробную загрязненность объекта. Для выявления грибов выполняется посев на сусло-агар или агар Сабуро. Смывы с рук работников получают, протирая ладони, межпальцевые и подногтевые пространства влажным стерильным тампоном. В пробирку со смывом наливают 5 мл среды Кесслера или Булира (для накопления Е. coli) и помещают пробирки в термостат при температуре 43⁰ С. На следующий день при наличии роста делают пересев на дифференциально-диагностическую среду Эндо. При появлении на ней типичных темно-красных колоний производят микроскопию и ставят оксидазную пробу. На основании результатов этих тестов делают вывод о наличии кишечной палочки. Для обнаружения золотистого стафилококка засевают смыв петлей штриховым методом на чашки Петри с желточно-солевым агаром. Идентификацию золотистого стафилококка проводят по общепринятым тестам.

Для получения смывов с аптечной посуды наливают 10 мл изотонического раствора хлорида натрия в исследуемую склянку или флакон, тщательно встряхивают, ополаскивают всю внутреннюю поверхность и делают посев 1 мл смыва в МПА или сусло-агар по вышеописанной методике.