Метод иммуноферментного анализа.
Для определения токсина применяется иммуноферментный анализ (ИФА) в твердофазном варианте с использованием моноклональных антитоксических противодифтерийных антител (МкАТ), полученных к СООН-концевому участку В-фрагмента дифтерийного токсина, ответственного за биологическое связывание с клетками макроорганизма, и иммобилизованных на полистироле. Используются также поликлональные антитоксические противотоксические антитела (ПкАТ), меченные ферментом-пероксидазой хрена.
Сорбированные на поверхности полистирола планшетов МкАТ связывают находящиеся в исследуемых пробах молекулы дифтерийного токсина и не связывают никаких др. продуктов микробного или иного происхождения. При наличии в анализируемых пробах токсина – поликлональный конъюгант с пероксидазной-моноклональные антитела-дифтерийный токсин проявляется субстратной смесью перекиси водорода с 5-аминосалиновой кислотой.
Учет реакции производят визуально или инструментально по изменению цвета субстратной смеси. Высокая чувствительность и специфичность метода позволяет выявить токсин в концентрации 4-8 нг/мл или 0,002 анатоксина.
Значительным преимуществом ИФА является возможность индикации токсина непосредственно в жидкой питательной среде, минуя этап выделения чистой культуры.
Реакция пассивной или непрямой агглютинации.
Реакция пассивной или непрямой агглютинации РПГА или РНГА-двухкомпонентная реакция, предполагает использование диагностикума эритроцитарного дифтерийного анатительного, действующим началом которого является связанные с эритроцитами очищенные специфической сорбцией поликлональные антитоксические противодифтерийные антитела, вступающие во взаимодействие лишь с дифтерийным токсином – анатоксином.
Чувствительность практически не уступает чувствительности ИФА.
По чувствительности, специфичности, времени проведения анализа ИФА РПГА и РНГА имеют преимущество перед РНАТ и реакцией преципитации в агаре.
ИФА и РПГА или РНГА позволяют выдать ответ о наличии токсина в исследуемом материале на 1-3 суток ранее традиционных методов. Следовательно, ИФА и РПГА или РНГА могут быть применены для ускоренного выявления токсина в материале от больных дифтерией, носителей токсигенных коринебактерий дифтерии; от лиц, обследуемых с профилактической целью или по эпидемическим показаниям, а также – в культурах, выделенных на разных этапах бактериологического исследования. Эти методы могут быть использованы в бактериологических лабораториях СЭС, больниц, клиник, научно-исследовательских институтов, предприятий по производству бактерийных препаратов, в биотехнологии.
Иммунологический контроль при дифтерийной инфекции.
Серологический контроль за дифтерийной инфекцией и столбняком осуществляется параллельно.
Для определения в сыворотке крови специфических антител используют реакцию пассивной (непрямой) гемагглютинации (РПГА, РНГА) с антигенными дифтерийным и столбнячным диагностикумами. Результаты выражают в показателях активности анатоксина (МЕ/мл). При использовании иммунореагентов НИИ эпидемиологии, микробиологии и инфекционных болезней Министерства здравоохранения РК титр РПГА с дифтерийным диагностикумом переводят в активность анатоксина по формуле Хд=0,2А, со
В
столбнячным – по формуле Хс=0,08А, где А– максимальное разведение испыту-
В
емой сыворотки с положительным результатом.
В условиях дефицита средств широкомасштабные серологические исследования проводить нецелесообразно. Для проведения серологических исследований предварительно определяется цель, методика, территория проведения иммунологического контроля. По результатам работы принимаются конкретные меры. Иммунореагенты для такого контроля производит НИИ эпидемиологии, микробиологии и инфекционных болезней МЗ РК.