Взятие и подготовка материала для вирусологической диагностики

Вирусологическому исследованию подвергают содержимое везикул, пустул, соскобы эпителия, спинномозговую жидкость, фекалии, мазки и смывы из верхних дыхательных путей, взятые у больного с соблюдением правил асептики в ранние стадии вирусной инфекции. Мазки из носоглотки и кожные соскобы помещают в ИРХН или раствор Хенкса с 10% сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиками (для подавления сопутствующей микрофлоры). Исследуемый материал хранят и пересылают в вирусологическую лабораторию в специальных контейнерах с сухим льдом. Пробы можно сохранять в условиях глубокой заморозки (-70⁰ С).

Вирусологический метод

Поскольку вирусы относятся к облигатным внутриклеточным паразитам и на искусственных питательных средах не растут, для их культивирования применяются живые системы (культуры клеток, развивающиеся куриные эмбрионы, чувствительные лабораторные животные).

Выделение вирусов на культурах клеток

В практике вирусологических лабораторий для выделения вирусов используют первично-трипсинированные, полуперевиваемые (дип­лоидные) и перевиваемые клеточные культуры.

Первично-трипсинированные культуры клеток можно получить из любых органов и тканей человека, животных, насекомых, растений, однако наиболее часто используются эмбриональные ткани (фибробласты куриного эмбриона, человека, и др.), обладающие повышенной способностью к росту и размножению.

Для получения клеточной взвеситкань отмывают от крови в растворе Хенкса, измельчают ножницами и несколько раз обрабатывают трипсином на магнитной мешалке или путем пипетирования. Затем взвесь клеток отмывают от трипсина раствором Хенкса путем центрифугирования при 600 об/мин в течение 5—10 мин, ресуспендируют в питательной среде и определяют концен­трацию клеток в камере Горяева. Клеточную взвесь разводят питательной средой (обычно среда № 199 с добавлением сыворотки крупного рогатого скота) до концентрации 4-8х10⁵ клеток в 1 мл, разливают в культуральные сосуды, закрывают резиновыми пробками. Пробирки укладывают под углом 5⁰. Культивирование клеток осуществляют в термостате при 35-37⁰ С 48-96 часов, в течение которых формируется монослой клеток, прикрепляющийся к поверхности стекла (или пластика).

С помощью версена (натриевая соль этилендиаминотетрауксусной кислоты - ЭДТА) (реже трипсина), клетки можно снять с поверхности культуральной емкости и перенести их в другую емкость (произвести пассаж). Для этого в сосуды с клетками после отсасывания питательной среды наливают 0,02% ра­створ версена или 0,25% трипсина и помещают их на 3-5 мин в термостат. Затем версен или трипсин удаляют, в культуральный сосуд добавляют небольшое количество питательной среды, в которой суспендируют клетки, подсчитывают их количество, доводят их до требуемой концентрации и разли­вают в новые флаконы. Однако первично-трипсинизированные клеточные культуры не выдерживают более 5-10 пассажей.

Перевиваемые клеточные культуры,в отличие от первично-трипсинированных, переносят неограниченное число пассажей, так как обычно их получают из опухолевых клеток, имеющих высокие способности к росту. Широкое распространение в вирусологии получили культуры клеток карциномы шейки матки (HeLa),раковой опухоли гортани (НЕр-2),костного мозга больного раком легких (Detroit-б) и т.д.Созданы «банки» перевиваемых клеточных культур, в которых хранятся клетки, замороженные жид­ким азотом.

Полуперевиваемые (диплоидные) культурыполучают путем нескольких пассажей, в результате чего формируется популяция клеток, способных выдержать до 60 пассажей, быстро размножаться, быть высокочувствительными ко многим вирусам, сохраняя при этом исходный набор хромосом.

Для культивирования клеток используются специальные стерильные питательные среды (например, среды 199, Игла, гидролизат лактальбумина и др.) с рН 7,2-7,6, содержащие полный набор аминокислот, витамины, факторы роста и набор минеральных веществ, к которым добавляют от 2 до 30 % сыворотки крови животных (сыворотка крупного рогатого скота, эмбриональная телячья сыворотка и др.), а также антибиотики для предотвращения роста бактериальной флоры. Среды содержат индикатор феноловый красный, который имеет оранжево-желтый цвет при кислой реакции среды и красно-малиновый цвет в щелочной среде. Поддерживающие среды либо не содержат сыворотки, либо содержат ее в небольшом количестве. Их применяют для сохранения вырос­ших клеток после заражения их вирусами.

Для выделения вирусов питательную среду из пробирок с культурой клеток удаляют, про­мывают монослой клеток раствором Хенкса для удаления сывороточных антител и ингибиторов, после чего в пробирку вносят 0,1-0,2 мл обработанного вируссодержащего материала. Через 30-60 мин после заражения материал из пробирки удаляют, вносят 1 мл поддер­живающей среды и пробирки помещают в термостат при 37⁰ С для культивирования.

Выделение вирусов на развивающихся куриных эмбрионах

Для культивирования вирусов используют6-15-дневные ку­риные эмбрионы. Заражение осуществляют на хорион-аллантоисную оболочку (ХАО), в желточный мешок, полость амниона и аллантоиса.

При заражении на ХАО скорлупу обрабатывают спиртом, йодом и снова спир­том. Скорлупу прокалывают над воздушным мешком, а сбоку в скорлупе делают отверстие размером 7x2 мм. Не повреждая оболочку под скорлупой, короткой тонкой иглой шприца наносят на ХАО 0,1—0,2 мл вирусосодержащего материала. Заражение в полость аллантоиса осуществляют путем введенияисследуе­мого материала шприцем на глу­бину 10—15 мм через боковое отверстие в скорлупе.

В полость амниона вирусосодержащий матери­ал вводят через отверстие на тупом конце яйца, при этом игла шприца должна быть направлена к телу эмбриона.

Дефекты скорлупы заливают стерильным парафином и эмбрионы помещают в термостат.