Проведение основного опыта

При постановке опыта крайне важна последовательность добавления компонентов. Опыт проводят в две фазы.

Фаза1. В пробирки наливают требуемое количество изотонического раствора натрия хлорида, затем- требуемый объем разведенной сыворотки и в таком же объеме рабочие дозы антигена и комплемента. Опыт обязательно сопровождают контролем всех участвующих в нем ингредиентов: сыворотки, антигена, гемолитической системы и комплемента.

Пробирки тщательно встряхивают и инкубируют при 37*С 45 мин. -1 ч. или при 4*С ("РСК на холоде") 18 ч. За это время при наличии специфического комплекса происходит связывание комплемента. Проведение реакции "на холоде" значительно повышает ее чувствительность и специфичность.

Фаза 2.По окончании инкубации во все пробирки добавляют по 1 мл

гемолитической системы, которую предварительно выдерживают в термостате 30 мин (сенсибилизируют). Пробирки встряхивают и снова ставят в термостат.

Учетрезультатов. Пробирки оставляют в термостате до полного гемолиза в 2, 3, 6, и 7-й пробирках (контроль сыворотки, антигена и комплемента на одну и две дозы). Раньше всего гемолиз наступит в 7-й пробирке, в которой находится двойное количество комплемента. После того как в этой пробирке произойдет гемолиз и содержимое ее станет совершенно прозрачным, нужно особенно внимательно следить за остальными контролями. Как только жидкость в 2, 3 и 6-й пробирках станет прозрачной, следует немедленно вынуть штатив с пробирками из термостата. О том, что опыт не задержали в термостате дольше, чем нужно, говорит наличие легкой мути(неполного гемолиза) в 5-й пробирке- в ней находится только половина рабочей дозы комплемента и полного гемолиза при правильной постановке опыта быть не может.

Гемолиз в контроле сыворотки и антигена (пробирки 2 и З) указывает на то, что дозы их были выбраны правильно и что сами по себе ни сыворотка, ни антиген комплемент не связывают.

В контроле гемолитической системы (пробирка 4) при ее правильной работе не должно быть даже следов гемолиза - в ней отсутствует комплемент.

Убедившись в том, что контроли прошли правильно, можно учитывать опыт. Отсутствие гемолиза в пробирках опыта расценивают как положительный результат реакции. Он свидетельствует о том, что в сыворотке есть антитела, специфичные в отношении взятого антигена. Образованный ими комплекс связал комплемент и воспрепятствовал его участию в реакции гемолиза. Если в опытных пробирках наступит гемолиз, результат реакции оценивают как отрицательный. В данном случаи нет соответствия между антигеном и антителом, комплемент не связан и участвует в реакции гемолиза.

Параллельно с сывороткой больного ставят такой же опыт с заведомо положительной сывороткой (т.е. с сывороткой, в которой есть антитела к данному антигену) и заведомо отрицательной, в которой нет спецефических антител. При правильной постановке опыта в первом случае должна быть задержка гемолиза, а во втором случае будет гемолиз.

Интенсивность реакции выражают следующим образом:

+ + + + полная задержка гемолиза. Эритроциты образуют равномерную муть или оседают на дно. В этом случае жидкость в пробирке становится бесцветной

+ + + лизировано примерно 25% эритроцитов. Осадок меньше, жидкость над ним слегка розовая. Результат РСК также оценивают как резко положительный.

+ + лизировано примерно 50 %эритроцитов. Осадок небольшой, жидкость розовая. Положительный результат РСК;

+ лизировано примерно на 75 %эритроцитов. Незначительный осадок, над ним интенсивно окрашенная жидкость. Сомнительный результат РСК;

- лизированывсе эритроциты. Жидкость интенсивно окрашена и совершенно прозрачна. Отрицательный результат РСК.

Контрольные вопросы.

1. В чем состоит принцип РСК?

2. Какие системы участвуют в РСК? Из чего состоит и какую роль в реакции выполняет гемолитическая система?

3. В чем состоит подготовка к основному опыту РСК? В какой последовательности его проводят? Сколько фаз в РСК?

4. О чем говорит отсутствие гемолиза в РСК?

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА №13

Реакция преципитации

В реакции преципитации происходит выпадение в осадок специфического иммунного комплекса, состоящего из растворимого антигена, которым может быть белок, комплексы белков с углеводами и липидами, бактериальные экстракты различные лизаты или фильтраты бульонных культур микробов и специфического антитела в присутствии электролитов. Образующееся в результате этой реакции мутное кольцо или осадок называют преципитатом, Антитела, участвующие в реакции преципитации, называются преципитинами. От реакции агглютинации эта реакция отличается размером частиц антигена, которые приближаются к размерам молекул.

Реакцию преципитации обычно применяют для определения антигена при диагностике ряда инфекций (сибирская язва, менингит и др.), определения видовой принадлежности крови, спермы, при установлении фальсификации продуктов. Для реакции необходимы:

1. Антитела (преципитины) - иммунная сыворотка с высоким титром антител (не ниже 1:100 000). Титр преципитируюшей сыворотки устанавливают по наибольшему разведению антигена, с которым она даёт реакцию. Сыворотку обычно применяют не разведённой или в разведении 1:5-1:10.

2. Антиген - растворённые вещества белковой или липоидносахаридной природы (полные антигены или гаптены).

3. Изотонический раствор.

Основные методы проведения реакции преципитации это реакция кольцеприципитации и реакция преципитации в агаре (геле).

Реакция кольцеприципитации

В преципитационную пробирку с помощью пастеровской пипетки вносят 0,2 - 0,3 мл. (5-6 капель) сыворотки (сыворотка не должна попадать на стенки пробирки). На сыворотку' осторожно наслаивают антиген в таком же объёме, наливая его тонкой пастеровской пипеткой; до стенке пробирки. Пробирку при этом держат в наклонном положении. При правильном наслаивании между сывороткой и антигеном должна получиться четкая граница. При положительном результате реакции на границе антигена и антитела образуется мутное <кольцо> - преципитат. Реакцию сопровождают рядом контролей.

Учёт результатовпроизводят через 5-30 минут, в некоторых случаях через час, как всегда начиная с контролей. <Кольцо> во второй пробирке свидетельствует о способности иммунной сыворотки вступать в специфическую реакцию с соответствующим антигеном. В 3 - 5 - и пробирках <колец> не должно быть - там нет соответствующих друг другу антител и антигенов. Наличие <кольца> в первой пробирке свидетельствует об образовании специфического иммунного комплекса (антиген + антитело), что позволяет идентифицировать искомый антиген. Если в качестве антигенов в реакции кольцепреципитации используют прокипяченные и профильтрованные водные экстракты органов и тканей, реакция носит название реакции термопреципитации (реакция Асколи).

Широкое распространение получили реакции преципитации в полужидком геле агара или агарозы -двойная иммунодиффузия по Оухтерлони, радиальная иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез и другие.

Для постановки реакции двойной иммунодиффузии по Оухтерлони растопленный агаровый гель выливают тонким слоем на стеклянную пластинку и после затвердевания вырезают в нём лунки размером 2-3 мм. В лунки раздельно помещают антигены и иммунные сыворотки, которые, диффундируя в агар, образуют в месте встречи преципитат в виде белой полосы.

При постановки реакции радиальной иммунодиффузии иммунную сыворотку вносят в агаровый гель. В лунки геля помещают раствор антигена, который, диффундируя в гель, образует кольцевые зоны преципитации вокруг лунок. Диаметр кольца преципитации пропорционален концентрации антигена. Реакцию используют, в частности, для определения содержания в крови иммуноглобулинов различных классов, компонентов системы комплимента.

Иммуноэлектрофорез сочетает метод электрофореза и реакцию преципитации; смесь антигенов разделяют в геле с помощью электрофореза, затем параллельно зонам электрофореза вносят иммунную сыворотку, антитела которой диффундируют в гель и образуют в месте встречи с антигеном линии преципитации. Разновидностью преципитации является реакция флоккуляции - появление опалесценции или хлопьевидной массы (иммунопреципитация) при реакции токсин -антитоксин или анатоксин - антитоксин; применяется для определения; активности анатоксина или антитоксической сыворотки.

Контрольные вопросы.

1. В чем основное различие между реакцией агглютинации и преципитации?

2. Почему нельзя применять мутные ингредиенты в реакции преципитации?

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА №14