Идентификация нуклеиновых кислот
Полимеразная цепная реакция (ПЦР). В случаях, когда в исследуемом материале ДНК или РНК мало или недостаточно для того, чтобы установить их точную генетическую принадлежность, прибегают к полимеразной цепной реакции, основу которой составляет катализируемое ДНК-полимеразой многократное образование копий определенного участка ДНК.
Вначале проводят термическое (t 95°) разделение двухнитевой молекулы ДНК на отдельные цепочки. После охлаждения в пробирку вносят праймеры (затравки), комплементарные нуклиотидным последовательностям обеих цепочек, содержащие не менее 20-30 нуклеотидов. Затем в среду вносят термостабильную tag-полимеразу (по названию микроба Thermus aquaticus ), что запускает образование вторичных копий цепей
РНК. Процесс удвоения повторяется 20 - 30 раз, что позволяет получить около миллиона копий ДНК. Полученную нуклеиновую кислоту идентифицируют с помощью электрофореза в 1% геле с окраской фракций ДНК бромидом этидия, яркосветящимся в ултрафиолетовых лучах. Полученные электрофореграммы анализируются. При проведении ПЦР используются специальные термостаты-циклеры, позволяющие быстро проводить нагревание и охлаждение исследуемых проб.
Метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот (НК) основывается на способности НК специфически соединяться (гибридизироваться) с комплементарными фрагментами гомологичных ДНК или РНК искусственно созданных нитей, меченных изотопами или ферментами (пероксидаза, щелочная фосфатаза).
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА
1. Постановка опыта конъюгации. Бригада студентов из трех-четырех человек используют культуру-донор Е. Сoli Нfr рго+, иrac +. Str.S и культуру-реципиент - Е соli F- рrol, иracl, hisl, str R В стерильной пробирке смешивают 1 мл культуры донора и 1 мл культуры реципиента и инкубируют в термостате 40 мин., после чего высевают 1 мл смеси на минимальную среду в чашку Петри. Минимальная среда для данного опыта содержит стрептомицин в концентрации, задерживающий рост культуры-донора. На ней могут вырасти лишь рекомбинанты родительских культур в случае их образования при конъюгации. Контроли: посев культур донора и реципиента на минимальную среду с антибиотиком. В обоих случаях роста не будет.
2. Постановка опыта трансдукции. Бригада студентов из трех-четырех человек использует культуру Е.соli Lac+ в качестве реципиента и транс-дуцирующий фаг, полученный путём индукции из лизогенной культуры Е соli Lac+. В стерильную пробирку вносят 1 мл культуры реципиента и 1 мл трансдуцирующего фага. Смесь инкубируют в термостате 40 мин и делают высев на среду Эндо. Контроли: 1. Высев культуры реципиента на среду Эндо (рост бесцветных колоний). 2. Высев на среду Эндо лизогенной культуры Е соli Lac+, из которой после облучения получен трансдуцирующий фаг (рост вишнево-красных колоний). На среде Эндо, засеянной из опытной смеси, вырастают и красные, и бесцветные колонии.
3. Постановка опыта трансформации. Бригада студентов из трех-четырех человек использует культуру стафилококка, чувствительную к пенициллину, в качестве реципиента и раствор ДНК, выделенной из донорской культуры 51., устойчивой к пенициллину. В стерильную пробирку вносят по 1мл культуры стафилококка, чувствительного к пенициллину, и раствор ДНК, полученный из культуры 51 резистентной к пенициллину, инкубируют 40 мин., после чего производят высев на среду с пенициллином. На чашке вырастают отдельные колонии резистентного к пенициллину стафилококка. Контроль: Высев культуры 51 реципиента на ту же среду (отсутствие роста колоний).
4. Опыт элиминации К -фактора. Бригада студентов из трех-четырех человек разводит бульонную культуру Е.соli Lac+ до концентрации 10 - 4 и переносит 0,1мл разведенной культуры в 1мл бульона (контроль) и в 1мл бульона, к которому добавлен 50мкг/мл акридиновый оранжевый, рH в обеих пробирках 7,6. После 18 - 24 инкубации в термостате из каждой пробирки готовят разведения культуры 10'4 и по 0,1мл высевают на чашки МПА содержащим по 200 мкг/мл тетрациклина и левомицетина,. Посевы ставят в термостат на сутки, после чего подсчитывают количество колоний в контрольном и опытном посевах. Количество колоний, выросших на чашке, засеянной из опытной пробирки, значительно меньше, чем в чашке, куда высеяна культура из контрольной пробирки, так как акридиновый оранжевый разрушает плазмидный R -фактор.
5. Каждый студент готовит препарат из культуры Рr.vulgaris, выросшей на обычном или карболовом агаре, и сравнивает его с препаратом напарника.
ДЕМОНСТРАЦИИ
1. Генетическая карта хромосомы Е,соli (схема).
2. Действие колицинов на индикаторную культуру Е,соli.
3. Опыты конъюгации, трансформации, трансдукции, элиминации R-фактора.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
1. Что такое рекомбинации у бактерий?
2. Что такое трансформация?
3. Что такое трансдукция?
4. Что такое конъюгация?
5. Что является трансформирующим агентом ?
6. Какие плазмидные элементы бактерий вы знаете ?
7. Какую роль играют плазмиды в жизнедеятельности бактерий ?
8. Каким образом можно изменить генотип бактерий?
9. Какими биологическими свойствами обладают рекомбинанты ?
10. В чем заключается феномен диссоциации бактерий?
11. Какими признаками характеризуются S-и R-формы бактерий?
12. Что такое мутация?
13. Каким образом можно изменить генотип бактерий?
14. Какие вы знаете мутагенные факторы?
15. Что такое модификация у бактерий?
16. Что такое минимальная среда и когда она используется?
17. Что такое ауксотроф?
18. Как получить ауксотрофы?
19. Каково значение фенотипической и генотипической изменчивости в экологии микробов?
20. В каких областях микробиологии применяется адаптационная изменчивость микробов?
21. Как проводится картирование хромосом у бактерий?
22. Каковы достижения генной инженерии в микробиологии?
23. Что лежит в основе генетических методов диагностики инфекционных заболеваний?
24. В чем заключается метод диагностики инфекционных заболеваний методом ПЦР?
25. В чем заключается метод диагностики инфекционных заболеваний методом молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот?
ЗАНЯТИЕ №11
Тема:
Инфекция и иммунитет
План занятия:
1. Инфекционный процесс, формы его проявления, пути передачи,
динамика развития инфекционного процесса.
2. Патогенность и вирулентность микроорганизмов, методы ее выявления и оценки.
3. Методы экспериментального заражения и иммунизации животных.
4. Бактериологическое исследование трупов животных.
5. Неспецифические клеточные и гуморальные факторы защиты организма человека (фагоцитоз, лизоцим, комплемент и др.), методы их изучения и оценки.
ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ
Инфекция - эволюционно сложившийся процесс взаимодействия трех факторов: патогенных микробов, макроорганизма и окружающей среды. Крайней степенью выраженности этого взаимодействия является инфекционное заболевание.
Патогенность микроорганизмов - потенциальная способность вызывать инфекционное заболевание у человека и животного. Это видовой генотипический признак микробов. Несмотря на большое разнообразие патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, все они пользуются примерно одинаковыми или сходными молекулярными инструментами для достижения своих целей при развитии инфекционного процесса. Сравнительно недавно установлено, что большая часть генов патогенности располагается на хромосомах отдельными кластерами из функционально связанных групп. Их стали называть «островками» или «островами» (в зависимости от величины) патогенности. Они располагаются на дискретных и часто имеющих чужеродное происхождение участках ДНК, кодирующих группы вирулентных признаков. Мобильность «островов» патогенности связана с тем, что они могут входить в состав ДНК бактериофагов, транспозонов или плазмид и участвовать в горизонтальном переносе генетической информации. Интеграция и экспрессия генов вирулентноcти лежит в основе формирования новых свойств у родственных непатогенных видов бактерий различных таксономических групп.
Вирулентность- это степень патогенности или фенотипическое проявление патогенности. Вирулентность измеряют следующими единицами: DLM (dosis certa letalis) - минимальная смертельная доза микроорганизмов, вызывающая гибель 70-80 % подопытных животных определенного вида и массы; DLM (dosis certa letalis) - безусловно смертельная доза, вызывающая 100 % гибель взятых в опыт животных; LD 50 - доза, вызывающая гибель 50% зараженных животных. Патогенность и вирулентность микроорганизмов обеспечивается наличием специальных биологических факторов, образуемых в результате метаболических процессов в бактериальной клетке. Их называют факторами патогенности. Каждый из них ответственен за проявление конкретных свойств микроорганизма в инфекционном процессе:
факторы адгезии и колонизации (пили, фимбрии, адгезины) - с их помощью бактерии распознают рецепторы на мембранах клеток, прикрепляются к ним и заселяют клетки;
факторы инвазии и агрессии (ферменты гиалуронидаза, плазмакоагулаза, фибринолизин, нейраминидаза, лецитиназа, ДНК-за и др.) - благодаря им бактерии проникают в ткани и распространяются;
антифагоцитарные факторы - либо маскируют бактерии от фагоцитоза (капсула), либо подавляют фагоцитоз (белок А у стафилококка, белок М у стрептококков, корд-фактор у микобактерий, V-W - антигены уY.pestis);
эндотоксины (липополисахариды и связанные с ними белки клеточной стенки) - имеются у грамотрицательных бактерий, высвобождаются после гибели клетки и обладают воспалительным и пирогенным действием;
экзотоксины - токсические микробные протеины, обычно ферменты, секретируемые в окружающую среду, которые убивают клетки хозяина в исключительно малых концентрациях (дифтерия, столбняк, ботулизм и др.).
Заражение лабораторных животных проводят с различными целями:
а) для моделирования инфекционных заболеваний;
б) для выделения чистой культуры возбудителя болезни;
в) для определения факторов вирулентности и измерения летальной дозы;
г) для проверки качества вакцин и иммунных сывороток.
Заражение животных производят разными способами (подкожно, внутрикожно, накожно, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно, через рот, в мозг, интраорбитально и др.) в зависимости от задач исследования и используемых животных.
Различают два уровня защиты от инфекции у человека: А) доиммунный, Б) иммунный или адаптационный.
А-Доиммунный или неспецифический механизм защиты обеспечивают:
• покровные ткани (кожа, слизистые оболочки);
• микробоцидные экзосекреты (соляная кислота желудочного сока, бак-териоцидные компоненты слюны, литические пищеварительные ферменты кишечника, лизоцим, и т.п.);
• сосудистые реакции в целях не пропустить во внутреннюю среду чужеродные агенты (быстрый локальный отек в очаге повреждения);
• первичный фагоцитоз микробных тел нейтрофилами и макрофагами;
• естественные клетки - киллеры;
• система белков комплемента;
• белки острой фазы – С - реактивный протеин и маннансвязывающий пектин (МСЛ), цитокины (интерфероны б, в, фактор некроза опухолей, интерлейкины 1, 6; хемокины);
•липидные медиаторы (простогландины, лейкотриены, фактор активности тромбоцитов);
• нормальная микрофлора тела человека.
Б. Иммунный (адаптационный, специфический) осуществляют Т- и В-лимфоциты.
Основные функции факторов доиммунной защиты: фагоцитоз, оп-сонизация, активация комплемента, хемотаксис, локальное воспаление, реакции острой фазы, лихорадка.
Фагоцитирующие клетки организма подразделяются на макрофаги и микрофаги. Макрофаги - это полиморфноядерные гранулоциты крови:
нейтрофилы, эозинофилы и базофилы. Макрофаги различных тканей вместе с моноцитами крови и костного мозга объединены в систему мононук-леарных фагоцитов (СМФ). Защитная роль фагоцитов от инфекционных агентов была впервые обнаружена И.И.Мечниковым. Кроме этого фагоциты (А-клетки) осуществляют презентацию антигенной информации эффекторным клеткам иммунной системы (Т- и В лимфоциты), запуская тем самым реакции иммунного ответа. Фагоцитам присуща также секреторная функция, связанная с выработкой монокинов (интерлейкин-1, фактор некроза опухолей) и других биологически активных веществ, играющих важную роль в иммуногенезе и неспецифической защите организма человека.
Фагоцитоз микроорганизмов может значительно усиливаться в присутствии различных белков крови, способных связывать некоторые бактерии и подготавливать их для поглощения фагоцитом. Такое явление называется «опсонизацией». Опсонизирующей активностью обладают активированные фракции комплемента (особенно фракция С,з), С-реактивный протеин (СРП) и иммуноглобулины (антитела).
Белки острой фазы воспаления (С - реактивный протеин и маннансвязывающий пектин) появляются в крови при тяжелых, системных воспалительныхпроцессах. Они синтезируются в печени по сигналу цитокинов (ТNF, IL-1, IL-6). При острой инфекции их можно определить в течение первых двух дней (когда нет еще антител). В этот ранний период СРП и МСЛ связывают и опсонизируют бактерии для фагоцитоза или активируют комплемент.
Эндогенные пептиды – антибиотики- новое направление исследований в изучении факторов доиммунной защиты. Пептиды-антибиотики состоят из 13-80 аминокислот, синтезируются эукариотическими клетками и обладают способностью убивать бактерии. В настоящее время известно более 400 наименований пептидов-антибиотиков. Они обнаружены в клетках растений, насекомых, лягушек, а также млекопитающих животных (кроликов, свиней, коров) и человека.
Цели занятия:
1. Изучить особенности и динамику развития инфекционного процесса, формы его проявления, пути передачи.
2. Изучить патогенность и вирулентность микроорганизмов, методы выявления и оценки.
3. Освоить основные методы экспериментального заражения и бактериологического исследования трупов животных.
4. Изучить виды и формы иммунитета.
5. Изучить неспецифические механизмы защиты организма, фагоцитоз.
Учебно-целевые задачи:
Знать:
1. Определение понятия «инфекция». Общая характеристика инфекционного процесса.
2. Понятия: патогенность и вирулентность. Факторы патогенности.
3. Определение понятия «иммунитет». Общая характеристика иммунной системы и ее основные функции.
4. Неспецифические факторы защиты организма: клеточные (фагоцитоз, естественные киллеры), гуморальные (система комплемента, интерфероны, лизоцим, белки острой фазы, противовирусные ингибиторы и др.).
Уметь:
1. Дать оценку значимости инфекционного процесса.
2. Провести бактериологическое исследование трупа лабораторных животных.
3. Дать оценку значимости неспецифических факторов защиты организма.
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
Для оценки доиммунных биологических механизмов резистентности к инфекции изучают:
1) содержание лизоцима, интерферона, комплемента, цитокинов в биологически активных средах (сыворотка, слюна, ликвор, слезная жидкость и т.д.);
2) фагоцитарную реакцию клеток крови, лимфатических узлов, селезенки и др. лимфоидных органов.
Содержание лизоцима в слюне или сыворотке крови определяют методом титрования с использованием культуры Micrococcus lysodeikticus. Лизис бактерий можно наблюдать по просветлению или измеряя спектро - фотометрическим методом изменение оптической плотности микробной взвеси после инкубации ее с разведениями лизоцима.
Содержание комплемента сыворотки крови определяют методом титрования по 50% гемолизу. Метод основан на комплементзависимом лизисе нагруженных антителами эритроцитов барана. За единицу активности комплемента принимается такое количество комплемента, которое вызывает 50% гемолиз в стандартных условиях. Отдельные компоненты системы комплемента определяют иммунохимическими методами при помощи моноклональных сывороток.