Выявление вирусов по цитопатическому эффекту
Цитопатический эффект - дегенерация клеток, возникающая под действием размножающегося в культуре ткани вируса. Микроскопически цитопатическое действие выражается в различных изменениях морфологии клеток, образовании гигантских многоядерных клеток (симпластов), пикнозе ядер и, наконец, в полной деструкции клеток. Макроскопически заметно слущивание клеток со стенок пробирки. Характер клеточной дегенерации зависит в основном от вида вируса.
ДЕМОНСТРАЦИИ
1. Приготовление препарата из нитчатых грибов.
2. Препарат-мазок из дрожжеподобных грибов Candida albicans.
3. Схемы морфологии и строения риккетсий и хламидий.
4. Токсоплазмы, малярийный плазмодий в готовых препаратах.
5. Схема строения вирусных частиц.
6. Тельца Бабеша - Негри в мозговой ткани животного, погибшего от
бешенства.
7. Схема строения бактериофагов.
8. Титрование бактериофага по Аппельману и по Грациа.
9. Биопрепараты бактериофагов.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА
1. Каждый студент готовит по 1 препарату нитчатых грибов,микроскопирует, зарисовывает в альбом.
2. Каждый студент готовит препарат из культуры дрожжевыхклеток,окрашивает по Нейссеру, микроскопирует, зарисовывает.
3. Приготовление мазка из риккетсиозного диагностикума.
4. Каждый студент готовит препарат из культуры грибов Candida albicans окрашивает по Граму (или метиленовой синькой), микроскопирует и зарисовывает.
5. Студенты изучают бакпрепараты из бактериофагов.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
1. Каковы морфологические отличия аскомицет от фикомицет?
2. Чем грибы отличаются от бактерий по морфологии?
3. Какое место в системе микроорганизмов занимают спирохеты?
4. Какие роды спирохет имеют медицинское значение?
5. Какие бактерии относятся к числу облигатных внутриклеточных?
6. Какие свойства указывают на принадлежность риккетсий к бактериям?
7. Какое главное биологическое свойство сближает риккетсий с вирусами?
8. Какова форма риккетсий?
9. Какой механизм обеспечивает внутриклеточное выживание риккетсий?
10. Какие свойства указывают на принадлежность хламидий к бактериям?
11. В чем особенность жизненного цикла хламидий?
12. В чем особенность функциональной организации простейшихпо сравнению с бактериями?
13. Назовите типы простейших, в которые входят виды, патогенные для человека.
14. Что лежит в основе диагностики протозойных инфекций?
15. Каковы структурные элементы вирионов?
16. Какие биологические свойства отличают вирусы от других микроорганизмов?
17. Какие свойства лежат в основе классификации вирусов?
18. Каким способом размножаются вирусы?
19. Какие изменения могут возникать в клетке в результате заражения ее вирусом?
20. Что такое элементарные вирусные частицы? Как их можно определить?
21. Какие структурные элементы имеет фаговая частица?
22. Чем отличается вирулентный бактериофаг от умеренного?
23. Какие фазы взаимодействия вирулентного фага и бактериальной клетки Вам известны?
24. Что такое явление лизогении?
25. Как измерить количество фаговых частиц в материале?
26. Для каких целей используются бактериофаги в медицине?
ЗАНЯТИЕ №5
Тема:
• Физиология бактерий. Питание и выращивание бактерий и
Вирусов.
План занятия:
1. Питание и выращивание бактерий. Классификация питательных сред.
2. Культивирование риккетсий, хламидий и вирусов.
3.Методы посевов и пересевов бактериальных культур, методы выделения чистых культур: по Дригальскому, Гольду,Коху и биобак-териологический.
ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ
Физиология микробов изучает вопросы питания, ферменты, рост и размножение микробов, их конструктивный и энергетический метаболизм.
Для роста и размножения микробной клетке необходима энергия. Она высвобождается в процессе окислительно-восстановительных реакций. Поступление питательных веществ в бактериальную клетку происходит в основном за счет осмоса и диффузии, а также обменной адсорбции. Для культивирования бактерий используются питательные среды. Их применяют для получения чистых культур микроорганизмов, изучения особенностей их морфологии и физиологии, а также для сохранения микроорганизмов в виде чистых культур в лабораторных и производственных условиях. Любая питательная среда должна соответствовать следующим требованиям: содержать все необходимые для роста питательные вещества в легко усвояемой форме; иметь оптимальную влажность, вязкость, рН, быть изотоничной, сбалансированной с высокой буферной емкостью и, по возможности, прозрачной. Для роста автотрофных бактерий потребности в питательных веществах довольно просты: вода, двуокись углерода и соответствующие неорганические соли. Гетеротрофные бактерии получают энергию в результате окисления восстановленных углеродных (органических) соединений. Некоторые из них, такие как E.coli, способны к росту на простой среде, содержащей только глюкозу и неорганические соли. Другие, например молочнокислые бактерии, - растут на сложных средах, содержащих в качестве добавок ряд органических соединений (витамины, аминокислоты и др.), которые клетки не в состоянии синтезировать самостоятельно. Такие соединения называютсяфакторами роста.Организмы, которые нуждаются в их добавлении к ростовой среде, называютсяауксотрофными по соответствующим соединениям. Другая группа организмов, способная к росту на простых средах, содержащих источник углерода и энергии, а также набор основных биогенных элементов, получила названиепрототрофных. Следует учитывать и то, что в природе встречаются бактерии, которые способны размножаться в местах с низким пищевым потоком углерода - до 0,1 мг/л в день, они получили названиеолиготрорфных, противоположную группу для них составляют бактериикопиотрофные, способные к росту на богатых пищевых субстратах.
По составусреды подразделяются на естественные, искусственные и синтетические. Естественные питательные среды - это натуральный продукт животного или растительного происхождения - молоко, яйца, овощи, животные ткани, желчь, сыворотка крови. Искусственные среды готовят по определенным рецептам из различных настоев или отваров животного или растительного происхождения с добавлением неорганических солей, углеводов и азотистых веществ. Синтетические среды содержат определенные химические соединения в точно указанных концентрациях. Например, минимальная среда Ледерберга часто используется для получения ауксотрофных мутантов. На таких средах культивируются прототрофы, использующие углерод глюкозы как единственный источник углерода и аммонийные соединения как единственный источник азота.
По консистенции среды бывают жидкие, полужидкие, плотные, сыпучие и сухие. Жидкие среды чаще применяют для изучения физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов, для накопления биомассы и продуктов обмена. Полужидкие среды обычно используют для хранения культур, плотные - для выделения микроорганизмов, изучения морфологии колоний, диагностических целей, количественного учета, определения антагонистических свойств и др.
Сыпучие среды обычно используют для хранения посевного материала, культур-продуцентов в микробиологической и медицинской промышленности. К ним относят разваренное пшено, кварцевый песок, пропитанный питательным раствором. В качестве уплотнителей в настоящее время используют агар, реже желатин и силикагель. Агар - полисахарид, выделенный из морских водорослей. Он способен образовывать в воде гели, плавящиеся при 100°С и уплотняющиеся при 45°С и ниже, не используемые микроорганизмами в качестве питательного субстрата. Несколько циклов плавления и затвердевания не влияют на способность агара образовывать гель, поэтому агаровые среды можно несколько раз стерилизовать. Агар к средам добавляют в количестве 1,5 -2% - для плотной среды или 0,4 - 0,7% -для полужидкой среды, которая может применяться для длительного хранения культуры без пересевов.
В бактериологической практике чаще всего используются сухие питательные среды, которые получают в промышленных масштабах -триптические гидролизаты дешевых непищевых продуктов (рыбные отходы, мясокостная мука, технический казеин) и питательный агар. Сухие среды могут храниться в течение длительного времени, удобны при транспортировке, имеют относительно стандартный состав.
Микротест - системы (МТС). Они представляют собой полистироловые пластины с лунками, в которых содержатся стерильные дифференциально-диагностические среды. Стерилизацию МТС проводят УФ-облучением. Микротест - системы особенно удобны при массовых бактериологических исследованиях в практических лабораториях.
По назначению среды подразделяются на обычные (простые), специальные, элективные, дифференциально-диагностические. Обычные среды используют для культивирования большинства микроорганизмов, это мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), сусло жидкое, сусло - агар. Специальные среды используют для выделения, культивирования и идентификации определенных групп или видов микроорганизмов.
Элективные среды используют при выделении определенного вида микроорганизмов из мест его естественного обитания и содержат компоненты с учетом биологических особенностей выделяемых микробов. Например, дифтерийные бактерии в силу их высокого паразитизма лучше всего растут на сывороточных средах или кровяных средах (Бучина, кровяно-теллуритовый агар, коринебакагар). В состав сред входит теллурит калия или натрия, в результате чего рост сопутствующих бактерий сильно задерживается. В противоположность этому холерный вибрион можно выращивать даже на «голодной» водной среде, содержащей всего 1% пептона, но при этом рН среды должна быть более 8,0.
Дифференциально-диагностические среды (например, среды Гисса, Симонса, Кларка, бульон Штерна) предназначены для изучения и индикации отдельных типов, видов и групп бактерий. В качестве основы применяют различные органические и неорганические соединения, гидролизаты казеина, пептонную воду, бульон Хоттингера-Мартена, дополненные углеводами, спиртами, мочевиной и другими веществами; при их расщеплении происходит сдвиг рН в кислую (углеводы, спирты, липиды) или щелочную (белки) сторону. Соответственно выделяют среды с углеводами и спиртами, среды с мочевиной, среды для определения индолообразования, среды для определения протеолитической активности и политропные, или комбинированные, среды. В такие среды также часто вносят различные индикаторы (например, бромтимоловый синий, индикатор Андреде, бромкрезоловый пурпурный, крезоловый красный), помогающие визуально определить изменение рН, характерное для различных микроорганизмов. В частности, сдвиг в кислую сторону вызывает покраснение среды с реактивом Андреде или пожелтение при использовании среды с бромтимоловым синим, тогда как при защелачивании индикатор Андреде и бромтимоловый синий не меняют цвет среды. Все дифференциально-диагностические среды разделяют на 4 основные группы.
А. Содержащие белки, дающие характерные изменения под действием бактериальных ферментов (кровь, желатин, молоко и др.); их применяют для определения гемолитических или протеолитических свойств. Наиболее распространенными средами являются МПЖ, свернувшаяся лошадиная сыворотка, молоко и кровяной агар (КА).
Б. Содержащие индикаторы, углеводы или многоатомные спирты; ферментативное расщепление приводит к сдвигу рН и изменению окраски среды. Наиболее распространены цветные среды с различными углеводами (например, с бромтимоловым синим, индикатором ВР) и лакмусовое молоко (среда Минкевича). Также широко распространены среды Гисса, на которых учитывают различия в способности ферментировать различные углеводы с образованием кислоты, либо кислоты и газа. Для дифференцировки энтеробактерий применяют пептонную воду с набором различных углеводов, индикатором Андреде и поплавками, облегчающими обнаружение газообразования; иначе такой набор называют «пестрый» (или цветной) ряд. Из углеводов наиболее часто используют моно - сахариды (ксилозу, арабинозу, глюкозу, фруктозу, маннозу, галактозу), дисахариды (лактозу, сахарозу), полисахариды (крахмал, гликоген, инулин, декстрин), спирты (дульцит, маннит, сорбит, глицерин) и гликозиды (адонит, инозит, салицин). Например, для выделения патогенных бактерий из кишечника применяют среды, которые позволяют дифференцировать патогенные микроорганизмы от постоянных обитателей кишечника - микроорганизмов, разлагающих лактозу. Такой средой является среда Эндо, в состав которой входит лактоза. Основными компонентами среды Эндо являются МПА, лактоза и основной фуксин, обесцвеченный сульфитом натрия. Исходная питательная среда окрашена в светло-розовый цвет. При сбраживании лактозы образуется ацетальдегид, который реагирует с сульфитом и окрашивает колонии в ярко-красный цвет. Поэтому кишечная палочка, которая сбраживает лактозу, при росте на этой среде образует красные колонии с металлическим блеском, а сальмонеллы и шигеллы - бесцветные, так как они не сбраживают лактозу
В. Среды для определения редуцирующей способности. В эту группу входят среды с красками, обесцвечивающимися при восстановлении (например, метиленовый голубой, нейтральный красный-агар Ротберга, ин-дигокармин - агар Омилянского), а также среды с нитратами для определения денитрифицирующей активности бактерий (при положительном результате среды окрашиваются в синий цвет).
Г. Среды, включающие вещества, ассимилируемые только определенной группой бактерий. Наиболее распространенными средами данной группы являются цитратный агар Симмонса и цитратная среда Козера.
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ
Культивирование микроорганизмов, помимо состава питательной среды, сильно зависит от физических и химических факторов (температура, кислотность, аэрация, свет и т. д.). При этом количественные показатели каждого из них неодинаковы и определяются особенностями метаболизма каждой группы бактерий. Существуют методы культивирования микроорганизмов на твердых и в жидких питательных средах в аэробных, анаэробных и микроаэрофильных условиях.
Проблема длительного хранения микроорганизмов сводится к созданию условий анабиоза, т. е. торможению процессов обмена веществ. Хранение микроорганизмов осуществляется в специальных коллекциях типовых культур. В коллекциях жизнеспособность микроорганизмов может поддерживаться следующими методами: 1) периодическими пересевами (субкультивирование); 2) под минеральным маслом; 3) высушиванием; 4) лиофилизацией; 5) в условиях низких и ультранизких температур.