Приготовление бактериального гаптена

Суточная культура бактерий на пластинках МПА в чашках Петри смывается 4-5 мл 1%-ной уксусной кислоты. Смыв кипятят на водяной бане 30-60 минут, фильтруют через асбестовую вату, фильтрат нейтрализуют 20 %-ным раствором углекислого натрия в присутствии индикатора. Полученный гаптен в количестве 0,5 мл наслаивают на равный объем преципитирующей сыворотки, цельной или разведенной вдвое. На границе между сывороткой и гаптеном появляется кольцо преципитата.

11. Реакция преципитации в агаре.

Реакция преципитации в агаре является одним из наиболее чувст­вительных методов анализа растворимых антигенов. Она позволяет выявить число индивидуальных антигенов в исследуемой жидкости (например, в бактериальных или тканевых экстрактах) и произвести анализ антигенного родства отдельных компонентов в смеси антигенов.

Для постановки реакции используют I %-ный агар, приготовленный на физиологическом растворе. Тщательно профильтрованный полностью прозрачный расплавленный агар разливают в чашки Петри слоем 0,5 см толщиной. После застывания в пластинке агара с помощью металлической трубочки вырезаются луночки диаметром 5-6 мм - одна в центре чашки и 4-5 по окружности на расстоянии 2 см от центральной. В цент­ральную луночку наливается сыворотка кролика, иммунизированного исследуемым антигеном, а в периферические - раствор исследуемого антигена и сравниваемых с ним веществ. Чашки помещаются в эксикатор с налитой на дно водой (для предупреждения высыхания) при комнатной температуре. Учет результатов реакции производится через 24, 48 и 72 часа.

Антитела из центральной луночки и антигены из периферических диффундируют, навстречу друг другу, и в участках, где создаются эквивалентные концентрации антител и антигенов, выпадает дугообразная полоса преципитации. Появление нескольких полос преципитации между центральной и периферическими луночками указывает на наличие нескольких антигенных компонентов в исследуемой жидкости. Если полосы преципитации, идущие от двух соседних луночек, сливаются, это ука­зывает на идентичность антигенов, содержащихся в этих луночках. Взаимное пересечение полос преципитации свидетельствует о серологи­ческой неидентичности антигенов.

Реакция кольцепреципитации: 1 – опыт 2 – контроль

Реакция преципитации в агаре

12. Реакция лизиса.

а) Реакция гемагглютинации. На чистое стекло наносят пастеровс­кой пипеткой каплю гемолитической сыворотки (инактивированной в отношении комплемента), рядом - другой пипеткой - каплю физиологического раствора. Затем в обе капли добавляют по I капле 4 %-ной взвеси эритроцитов барана (не касаться пипеткой капли сыворотки). С помощью бактериальной петли перемешивают добавленные эритроциты сначала с физиологическим раствором, а затем с сывороткой (но не наоборот!). Реакция склеивания эритроцитов (гемагглютинация) происходит только в опытной капле. Она наступает быстрее при легком покачивании стекла и осторожном подогревании. В контрольной капле склеивания эритроцитов не происходит (так как там отсутствуют антитела);

б) реакция гемолиза. На чистое стекло наносят на расстоянии 1,5 см друг от друга две капли гемолитической сыворотки в разведении 1:300. На таком же расстоянии от второй капли наносят другой пипеткой каплю физиологического раствора. Во все три капли чистой пасте­ровской пипеткой добавляют по I капле 4%-ной взвеси отмытых бара­ньих эритроцитов. После этого в первую и третью капли добавляют по I капле комплемента (свежая сыворотка морской свинки) в разведении 1:10, а во вторую каплю вместо комплемента добавляют физиологичес­кий раствор в том же объеме. После этого содержимое всех капель тщательно перемешивают (перед каждым перемешиванием петля должна быть прокалена и остужена). Для ускорения наступления реакции стек­ла могут быть слегка подогреты высоко над пламенем спиртовки или в термостате 10 минут. Реакция гемолиза происходит только в первой капле, в которой содержатся все необходимые для этого ингредиенты: эритроциты, антитела (сыворотка) и комплемент. Во второй капле про­изойдет реакция агглютинации, так как в ней имеются антиген (эрит­роциты) и антитела (сыворотка), но нет комплемента. В третьей капле (эритроциты + комплемент; никаких видимых изменений не произойдет.

Результат РПГА

	Контроль	Разведения сыворотки
1:20	1:40	1:80	1:160	1:320	1:1640	1:1280
Степень агглютинации

Вывод_________________

13. Реакция связывания комплемента. Разбор методики постановки РСК, определения рабочих доз антигена, комплемента, получения гемолитической сыворотки. Для постановки основного опыта РСК необходимы следующие ингредиенты:

а) антиген, рабочая доза которого уже оттитрована;

б) исследуемая сыворотка;

в) комплемент, рабочая доза которого должна быть также оттит­рована:

г) гемолитическая сыворотка с известным титром;

д) 3 %-ная взвесь отмытых эритроцитов барана;

е) физиологический раствор.

Антиген для реакции связывания комплемента готовится из соответствующих микроорганизмов (бактерий, вирусов) или может быть неспецифическим (в реакции Вассермана – кардиолипиновый антиген). В связи с тем, что антиген может обладать антикомплементарным действием, перед постановкой опыта он титруется, т.е. устанавливается его рабочая доза. Титром антигена считается такая доза последнего, которая не вызывает задержки гемолиза. Для работы берут дозу антигена, равную половине его титра.

Источником комплемента для РСК служит свежая (или высушенная) сыворотка крови морской свинки. Титром комплемента называется его минимальное количество, которое в присутствии рабочей дозы гемолитической сыворотки обеспечивает полное растворение эритроцитов. Для постановки основного опыта берут дозу комплемента, увеличенную на 20-25% по сравнению с установленным титром.

Гемолитическую сыворотку получают иммунизацией кролика эритроцитами барана. Титром гемолитической сыворотки называется то макси­мальное разведение ее; которое, будучи смешано с равным объемом (0,5 мл) 10%-ного раствора комплемента, полностью гемолизирует 0,5 мл взвеси эритроцитов в течение 1 часа при 37 °С . В основной опыт бе­рется сыворотка, разведенная до 1/3 своего титра. Так, если титр сы­воротки 1:1200, то в опыт берется сыворотка в разведении 1:400.

Исследуемая сыворотка (т.е. сыворотка больного) перед опытом инактивируется при 56 °С в течение 30 минут, чтобы исключить действие имеющегося в ней комплемента. В реакцию следует брать сыворотку в разведении 1:5.

Все ингредиенты для РСК берут в дозе по 0,5 мл. Недостающее количество компонентов доводят до указанного объема физиологическим раствором. Титрование ингредиентов производят накануне постановки реакции.