Лабораторная диагностика микозов, вызываемых условно-патогенными грибами

(оппортунистические микозы)

Условно-патогенные грибы обычно являются сапрофитами, обитающими во внешней среде, а также на коже и слизистых оболочках человека. Оппортунистические микозы возникают при длительном контакте чело­века с возбудителем, на фоне иммунодефицита, нерациональной антибиотико- и химиотерапии, приводящей к дисбактериозу и т. д. Некоторые грибы в благоприятных для них условиях способны размножаться в пищевых продуктах (например, в злаках) и накапливать сильнодействующие микотоксины, вызывающие тяжелые пищевые отравления (алиментарные микотоксикозы).

Кандидоз (кандидамикоз)

Возбудителями кандидоза – повсеместно распространенного заболевания являются дрожжеподобные грибы рода Candida (наиболее часто встречается видCandida albicans, реже - Candida tropicalis, Candida pseudotropicalis, Candida krusei, Candida glabrata и т.д.). Кандидоз относится к типичным аутоинфекциям, проявляясь избыточным ростом дрожжеподобных грибов, заселяющих кожу, ногти, слизистые оболочки, внутренние органы. Обычно это заболевание возникает при патологии, связанной с формированием иммунодефицита (сахарный диабет, другие эндокринные болезни, гипо- и авитаминозы, иммунодепрессивная и лучевая терапия, СПИД и т.д.), при дисбактериозе, обусловленном длительным приемом антибиотиков. Наиболее подвержены кандидозу дети и старики.

Выделяют поверхностный кандидоз слизистых оболочек, кожи, ногтевых валиков и ногтей. Кандидоз слизистых оболочек полости рта или влагалища (молочница) характеризуется появлением белого налета, напоминающего свернутое молоко

Хронический генерализованный канди­доз обычно развивается у детей с иммунодефицитными состояниями, имеет медленно прогрессирующее течение с возникновением пневмоний, гастритов, гепатитов и др.

При висцеральном кандидозе поражаются желудочно-ки­шечный тракт, органы дыхания, мочевыделительная система, ЦНС.

Аллергические формы кандидоза развиваются на фоне имеющегося первичного очага кандидомикоза в результате сенсибилизация организма, при этом могут возникать новые очаги воспаления, в которых возбудитель отсутствует.

Мате­риалом для исследования при кандидозе являются чешуйки кожи и соскоб с ног­тей, отделяемое и пленки со слизистой оболочки губ, полости рта, влагалища, мочеиспускательного канала, наружно­го слухового прохода, а также с конъюнктивы. При висцеральном кандидозе исследуют кровь, спинномозговую жидкость, мокроту, испражнения, мочу, желчь, мазки со слизи­стых оболочек, биоптаты тканей, пунктаты абсцессов, секционный материал.

Лабораторная диагностика кандидоза включает микроскопию нативных препаратов, выделение чистой культуры гриба, обнаружение в материалах антигенов или нуклеиновых кислот, постановку серологических реакций, аллергических проб.

Микроскопический метод -изу­чение неокрашенных и окрашенных по Граму, Романовскому-Гимзе, Цилю-Нильсену препаратов из исследуемого материала, в которых обнаруживают круглые или овальные почкующиеся дрожжеподобные клетки, раз­мером от 3-6 мкм, и псевдомицелий в виде цепочек удлиненных клеток (рис. 37). Некоторые виды дрожжеподобных грибов (C.albicans) образуют терминальные хламидоспоры.

По Граму грибы рода Candidaокрашиваются в темно-фиолето­вый цвет, по Цилю-Нильсену - в синий с розово-желтыми включениями липидов, по Романовскому-Гимзе — в розовато-желтый цвет с темно-фиолетовыми включе­ниями волютина и красным хроматиновым веществом.

Микологическое исследование.Выделение чистой культуры дрожжеподобных грибов про­изводят на плотных средах (обычно среде Сабуро, сусло-агаре, Кандида-агаре или др.) с добавлением антибиотиков (пенициллин, стрептомицин и т.д.) для подавления роста сопутствующих бактерий. Через 2-3 дня культивирования при 30-37⁰ С образуются круглые, диаметром до 1 см, выпуклые сметанообразные гладкие колонии белого цвета с ровными краями и глубоким врастанием в среду ветвистого древовидного псевдомицелия.

Выде­ленную чистую культуру пересевают в жидкие среды ( картофельную, кукурузную среды, морковно-картофельный отвар и др.) для выявления псевдомицелия, появляющегося обычно на 3-5 день культивирования (реже на 10-15 день и позже) В жидких питательных средах Candida образуют равномерное помутнение, осадок или пленку на поверхности среды. Наряду с псевдо­мицелием, у этих грибов можно найти истинный мицелий и хламидоспоры (крупные двухконтурные споры с зернистым содержимым) при посеве на рисовый или Хламидоспор-агар с последующим культивированием гриба в усло­виях пониженной температуры и концентрации кислорода..

Рис. 37. Возбудитель кандидамикоза(Candida albicans) в исследуемом материале

Бластоспоры (почки) у дрожжеподобных грибов рода Candida располагаются нерегулярно по обеим сторонам мицелия, хламидоспоры круглые, крупные (10-20мкм), двухконтурные. C.albicans сбраживает глюкозу, мальтозу, левулезу и частично га­лактозу; молоко не изменяет.

Идентификация дрожжеподобных грибов рода Candidaдо уровня вида основывается на определении типа филаментации, наличия хламидоспор, ферментативной активности (табл. 24).

Таблица 24. Сахаролитические свойства дрожжеподобных грибов рода Candida.

Вид гриба	Сахара
	глюкоза	мальтоза	лактоза	галактоза	сахароза
Candida albicans	кг	кн	-	кг	-
Candida tropicalis	кг	кг	-	кг	кг
Candida pseudotropicalis	кг	-	кг	кг	кг
Candida krusei	кг	-	кг	-	-

Обозначения: кг – расщепление субстрата с образованием кислоты и газа

Характерным дифференциальным признаком, отличающим вид С.Albicans от других видов дрожжеподобных грибов рода Candida, является их способность образовывать ростовые трубки - трубкообразные выросты бластоспор (признак РТ). Для этого часть колонии гри­бов переносят в 0,5 мл сте­рильной сыворотки теленка, пробирки помещают в термостат при 37⁰ С на 2,5-3,0 часа, после чего готовят препарат раздавленной капли и микроскопируют под большим увеличением микроскопа (объектив х40). У ростовых трубок отсутствует перемычка или сужение на месте соединения с бластоспорой, они тоньше, чем удлиненная бластоспора или псевдомицелий у С. tropicalis.

Для дифференциации с другими грибами у культур дрожжеподобных грибов определяют наличие капсулы и уреазы (у кандид они отсутствуют), определяют способность ассимилировать и ферментировать угле­воды (глюкозу, мальтозу, сахарозу, галактозу и др.).

Для быстрой идентификации С. albicansразработаныспециальные диски с хромогенными субстратами, позволяющие выяв­ить специфичные для этого вида грибов ферменты L-пролинаминопептидазу и 3-галактозамидазу. На диск наносят суточную культуру гриба, инкубируют 30 мин при 35 °С, затем добавляют 1 каплю 0,3%-го раствора гидроксида натрия. Появление желтого окрашивания свидетельствует об активности L-пролинаминопептидазы. Затем добавляют 1 каплю коричного альдегида; развитие в течение 1 мин розово-красного окрашивания свиде­тельствует о наличии 3-галактозамидазы. Положительный тест на оба фермента в сочетании с наличием ростовых трубок считаются достаточными для идентификации С. albicans.

Серологический метод(постановкаРСК, РА, ИФА. РНГА, ВИЭФ и др. с парными сыворотка­ми крови больных с целью определения специфических антител) обычно прово­дится при висцеральных формах кандидоза. Результаты исследования счита­ют положительными при нарастании титра антител более чем в 4 раза в динамике заболевания. Для РА используются корпускулярные антигены, для РСК очищенные полисахариды, лизаты или ультразвуковые дезинтеграты дрожжеподобных грибов.

Аллергологический метод(преимущественно у больных висцеральным кандидозом)- постановка внутрикожной аллергичес­кой пробы со стандартным кандидозным аллергеном, представляющим взвесь клеток грибов, прогретую при 80⁰ С в тече­ние 2 ч. Результаты реакции (гипере­мия, папула) учитывают через 24 — 48 ч. В связи с широким распро­странением сенсибилизации к антигенам грибов аллергопроба имеет ограниченное диагностическое значение.

Генодиагностика - разработана ПЦР для инидикации видоспецифического фраг­мента ДНК С. albicans.