Методы культивирования облигатных внутриклеточных бактерий (риккетсий, хламидий) и вирусов

Для культивирования вирусов (так же, как и для других облигатных паразитов - риккетсий и хламидий) используют куриные эмбрионы, культуры тканей и лабораторных животных.

Куриный эмбрион - удобная модель для культивирования вирусов в целях получения вирусов и для приготовления диагностических, профилактических и лечебных препаратов - диагностикумов и вакцин. Куриные зародыши используют в возрасте от 8 до 12 дней, перед заражением инфекционным материалом скорлупу яйца над воздушной камерой обрабатывают 70% спиртом, обжигают, смазывают йодом (2% настойка), вторично протирают спиртом и обжигают. Вируссодержащий материал, обработанный для удаления бактериальной флоры, в асептических условиях наносят на хорион-аллантоисную оболочку или вводят в желточный мешок, аллантоисную полость, либо в амнион (ткань эмбриона). После заражения в аллантоисную полость через отверстие заливают парафин;

если материалом заражают хорион-аллантоис, отверстие в скорлупе закрывают стерильным покровным стеклом, края которого замазывают парафином. После инфицирования эмбрионы помещают в термостат при 37°С. Признаки репродукции вируса проявляются особенно четко в месте заражения на хорион-аллантоисной оболочке в виде очагов поражения и геморрагий или для его обнаружения применяют специальные реакции (например, реакцию гемагглютинации - РГА).

Культуры клеток (тканей) получают из тканей животных и человека. Их делят на первичные, которые используют в течение одной генерации, и перевиваемые, которые поддерживают путем пассажей (перевивок) длительное время. Клетки перевиваемой культуры ткани готовят из нормальных (чаще эмбриональных) и злокачественных линий клеток, они способны сравнительно прочно прикрепляться к стеклу флакона, образовывать монослой клеток и многократно размножаться in vitro. Для поддержания жизнеспособности клеток применяются специальные синтетические среды (например, среда 199, среда Хэнкса), содержащие аминокислоты, витамины, глюкозу, минеральные соли с добавлением 5 -10% коровьей или лошадиной сыворотки. Трипсин используется при получении культуры клеток для дезагрегации тканей, т.е. для разобщения клеток. Репродукция вирусов в культуре клеток сопровождается так называемым цитопатическим действием (ЦПД), которое проявляется в изменении морфологии клеток и их гибели или образования синцития, а в некоторых случаях - в возникновении в инфицированных клетках клеточных включений. Характер и время проявления ЦПД зависит от вида вируса.

Для создания моделей вирусных инфекционных болезней и выделения вирусов используют лабораторных животных (белых мышей, хомяков, крыс, кроликов и др.). Чувствительность животных к вирусам зависит от вида животного и его возраста.

Культивирование риккетсий

Риккетсии являются облигатными паразитами, их культивирование возможно только в живых тканях. Обычно их выращивают в желточном мешке куриного эмбриона.

Культивирование хламидий

Хламидии можно размножать в желточном мешке куриного эмбриона или в культурах тканей позвоночных. Размножение в куриных эмбрионах происходит в температурных границах 33 - 41°С и даже более широких, но чувствительность к обеим крайним температурам и оптимум для роста варьирует от вида к виду.

Цели занятия:

1. Изучить принципы классификации питательных сред, методы выявления культуральных свойств бактерий на различных питательных средах и вирусов в различных условиях культивирования.

2. Освоить технику посевов бактерий на плотные и жидкие питательные среды.

3. Начать освоение методики выделения чистых культур аэробов.

Учебно-целевые задачи:

Знать:

1. Метаболизм микроорганизмов.

2. Источники углерода, азота, макро- и микроэлементов, ростовых факторов для микробов. Аутотрофы и гетеротрофы. Фототрофы и хемотрофы.

3.Питательные среды. Механизм переноса питательных веществ в бактериальную клетку

4. Определение понятий: культура, штамм, клон. Колонии, особенности их формирования у различных видов бактерий.

5.Принципы культивирования различных групп микроорганизмов.

Культуральные свойства бактерий.

6. Механизм и скорость размножения микроорганизмов. Фазы размножения микроорганизмов в жидкой питательной среде в стационарных условиях. Образование микробами пигментов, токсинов, витаминов, аминокислот, полисахаридов и других веществ.

7. Особенности роста и размножения риккетсий, хламидий и вирусов.

8. Методы культивирования бактерий, в том числе облигатных внутриклеточных: (риккетсий, хламидий) и вирусов.

Уметь:

1. Владеть техникой посева бактерий на жидкие и плотные питательные среды.

2. Описать культуральные свойства микроорганизмов.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ