Медицинская экология микроорганизмов (продолжение): нормальная микрофлора тела человека.
План занятия:
1. Качественный и количественный состав микрофлоры организма человека.
2. Методы определения состава микрофлоры тела человека. Дисбактериоз.
ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ
Сочетание микробных ассоциаций, встречающихся в организме человека, составляет его микрофлору. Микробные биоценозы, сформировавшиеся в различных полостях тела человека в процессе эволюции и в результате селекции наиболее приспособленных к условиям существования характеризуются относительным постоянством. Но на качественный и количественный состав микроорганизмов влияют многие факторы: возраст, пол, особенности питания, микробы окружающей среды, и в особенности антибиотики и другие химио-терапевтические и иммунологические препараты, применяемые в лечебно-профилактических целях.
Формирование состава микрофлоры регулируется антагонистическими и синергетическими отношениями между отдельными ее представителями в составе биоценозов, а также контролируется физиологическими факторами микроорганизма.
Микрофлора тела человека представлена постоянно находящимися микроорганизмами в той или иной полости (автохтонная или индигенная микрофлора) и случайной или факультативной (аллохтонной) флорой. К первой группе - облигатной или резидентной - относятся микробы, максимально приспособленные к существованию в организме человека - это сапрофиты и условно-патогенные виды. Основу нормальной микрофлоры человека составляют облигатно-анаэробные бактерии. Факультативная и транзиторная микрофлора является временной и необязательной. В ее состав входят также сапрофитные и условно-патогенные микроорганизмы. Иногда в организме здоровых людей могут встречаться патогенные микробы и вирусы.
Естественной формой существования в природе любых микроорганизмов является иммобилизованное состояние, т.е.99,9% бактерий обитает в виде фиксированных к различным поверхностям микроколоний, заключенных в полисахаридный гликокаликс бактериального происхождения, который защищает микроорганизмы от других микробов, бактериофагов и прочих неблагоприятных факторов. Представители автохтонной микрофлоры в животном организме способны фиксироваться лишь к строго определенным рецепторам кожи и слизистых, образуя при этом биопленку, защищающую слизистые от колонизации другими микроорганизмами. Элементами, ответственными за специфическую адгезию, являются поверхностные структуры бактерий, содержащие пектины, которые комплементарны соответствующим рецепторам, расположенным на мембранах эпителиальных клеток.
Несмотря на определенную стабильность, состав автохтонной бактериальной популяции в биопленке может изменяться под влиянием разнообразных факторов (фармакологические препараты, промышленные яды, пестициды, радиация, стрессы, гормоны и т.п.). В тех случаях, когда воздействующие факторы по своей интенсивности превышают компенсаторные возможности микробной экосистемы, возникающие дисбиотические нарушения могут стать пусковым механизмом развития и поддержания различных патологических состояний. В настоящее время существенно расширился спектр клинических синдромов и патологических состояний, патогенез которых может быть связан с изменением состава и функций нормальной микрофлоры (диарея, запоры, колиты, гастриты, дуодениты, язвенная болезнь, коагулопатии, гипо-и гипертензия, острая мезентериальная ишемия, гипо- и гиперхолестеринемия, кариес, моче- и желчекаменная болезнь, злокачественные новообразования и др.).
Некоторые представители нормальной микрофлоры человека относятся к условно-патогенным (стафилококки, эшерихии, бактероиды и др.). А поэтому при определенных условиях (снижение колонизационной резистентности, смена среды обитания, ослабление защитных сил организма и др.) становятся причиной эндогенных инфекций различной локализации.
Микрофлора кожи. Кожа, особенно её открытые части, обсеменены различными микробами. Микрофлора кожи складывается не только из микробов, находящихся на поверхности, но и в глубине кожи (волосяные мешочки, протоки сальных и потовых желез). На грязной коже многие микробы способны не только сохранять жизнеспособность, но и размножаться. На поверхности чистой кожи микроорганизмы быстро гибнут.
Неповреждённые кожные покровы для большинства микроорганизмов, в том числе и патогенных, непроходимы. При нарушении же целостности кожных покровов, а также при снижении общей резистентности микроорганизма на коже могут возникать различные заболевания: гнойничковые элементы, инфицированные мацерации, вызванные бактериями, грибками, вирусами.
Микрофлору кожи составляют микроорганизмы как постоянно живущие на ней, так и разнообразная заносная микрофлора, попадающая из внешней среды (из воды, воздуха, почвы) при соприкосновении с загрязнёнными объектами внешней среды или полостями организма (рот, кишечник, полость носа и др.).
Преобладающим представителем кожной микрофлоры являются анаэробные пропионобактерии (преимущественно Р.ances). Здесь же в значительных количествах присутствуют стафилококки, дифтероиды, грибы рода Candida. Микрофлора коньюктивы, как правило, по составу схожа с микрофлорой кожи.
Микрофлора полости рта разнообразна и многочисленна, поскольку в ротовой полости создаются благоприятные условия для жизнедеятельности микроорганизмов. Это щелочная реакция слюны, пищевые остатки, «термостатная» температура и влажность. Особенно много их локализуется в зубном налёте, между зубами, в криптах и лакунах миндалин. В ротовой полости встречается более 300 видов микроорганизмов. Их можно разделить на постоянную (резидентную) и факультативную микрофлору. Более многочисленны анаэробы (бактероиды, пептококки, лептотрихии, фузобактерии, вейлонеллы).
Резидентную группу составляют стрептококки (Str.salivarius, Str. mutans Str. sanguis), непатогенные стафилококки, диплококки, коринебактерии, лактобациллы, вейлонеллы, трепонемы (Tr. Buccalis ), дрожжеподобные грибы (Candida albicans), актиномицеты, микоплазмы, простейшие.
Среди факультативных микроорганизмов встречаются энтеробактерии (роды Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Proteus), синегнойная палочка, спорообразующие - бациллы, клостридии, а также пептострептококки и пептококки. Некоторое время в ротовой полости могут персистировать вибрионы, спирохеты, дифтерийная палочка, менингококки и др.
В поддержании количественного и качественного постоянства нормальной микрофлоры полости рта главную роль играет слюна, обладающая антибактериальной активностью за счёт содержания в ней ферментов (лизоцим, лактоферрин, пероксидаза, нуклеаза) и секреторных иммуноглобулинов. Индивидуальные колебания в составе микрофлоры полости рта зависят от возраста, гигиенических навыков, диеты, общей резистентности организма и резистентности слизистых оболочек, наличия дефектов зубов.
Нормальная микрофлора полости рта обеспечивает её защиту за счёт конкуренции, антагонизма по отношению к патогенным микроорганизмам, таким как дифтерийный возбудитель, патогенные стафилококки и
стрептококки, менингококки, условно-патогенные и патогенные грибы. В случае же нарушения микрофлоры, то есть возникновения дисбактериоза, патогенные и условно-патогенные микробы могут вызывать заболевания органов полости рта (кариес, парадонтоз, гингивит) или обеспечивать, так называемую «нисходящую инфекцию» из полости рта в глотку, гортань, желудок, трахею, бронхи, лёгкие.
Микрофлора желудка бедна, поскольку большинство попадающих сюда микроорганизмов погибают под действием соляной кислоты желудочного сока. Однако при нарушении общего и местного гомеостаза в желудке могут появляться условно-патогенные микроорганизмы, которые способствуют возникновению гастритов и язвенной болезни (Helicobacter).
В тонком кишечнике в норме микроорганизмы либо отсутствуют, либо их количество невелико. Из выявляемых бактерий чаще обнаруживаются энтерококки, лактобактерии. Иногда высеваются сарцины, грибы.
В толстом кишечнике регистрируется самая разнообразная по составу микрофлора. Биомасса микроорганизмов, заселяющих кишечник взрослого человека, составляет 2,5 - 3 кг и включает в себя до 450 видов. Нормальная микрофлора кишечника на 92 - 95% состоит из строго анаэробных видов, остальная часть-аэробы.
Микроорганизмы толстого кишечника
| Анаэробные бактерии Грамотрицательные бактерии Вacteroides | Аэробные Грамотрицательные бактерии Е.соli |
| B.fragilis B.putidum и др. группа Veillonella Грамположительные бактерии | Enterobacter, Citrobacter, klebsiella, Proteus, providential, Pseudomonas Грамположительные бактерии |
| Лактобактерии: L. fermentum, L acidophilis, L platinum. Бифидобактерии B. bifidum B. longum B. infantis, B. adolescentis, B. fermentum | Bac.subtillis, Bac. brevis, молочнокислые бактерии, дифтероиды, энтерококки |
| Группа Спороносные бактерии Cl. perfringens, Cl. tetani Cl. botulinum Cl. sporogenes Группа шаровидных Peptostreptococcs Sp. Peptococcus. Sp | Стафилококки и микрококки, грибы рода Candida Плесневые грибы Группа актиномицетов A. israelii и др. |
Кишечную микрофлору делят на облигатную и факультативную. К облигатным микробам относят буфидумбактерии, лактобактерии, бактероиды, кишечные палочки, энтерококки. К факультативным бактериям толстого кишечника относят сапрофитные, условно-патогенные, патогенные виды микробов.
Представители нормальной микрофлоры, обладая высоким сродством к рецепторам энтероцитов и адгезируя с ними, формируют на поверхности слизистых защитный биослой, обеспечивающий колонизационную ре-зистентность. Вместе с тем нормальная микрофлора способствует созреванию, особенного у детей раннего возраста, общего и местного иммунитета. Благодаря этому возрастает синтез иммуноглобулинов, комплемента, лизоцима.
В процессе жизнедеятельности нормальной кишечной флоры выделяются органические кислоты и антибиотические вещества (колицины, лактолин, низин, стрептоцин), что препятствует размножению болезнетворных и гнилостных бактерий, а вместе с тем способствует снижению синтеза аммиака, токсических аминов, фенола, сероводорода, крезола и других токсических продуктов.
Нормальная кишечная аутофлора принимает активное участие в процессах пищеварения, расщепляя поступившие из тонкого кишечника нерасщепленные белки, жиры и углеводы, а образующиеся при этом продукты, стимулируют перистальтику Кишечная аутофлора принимает участие в биохимических процессах жирового и пигментного обмена, в частности обмена холина, желчных и жирных кислот с образованием дезоксихолевой кислоты, копростерина, уробилина. Кишечная микрофлора благоприятно влияет на процессы всасывания и обмена веществ, утилизации кальция, железа, витамина Д. Она тормозит процессы декарбоксилирования пищевого гистидина, уменьшая тем самым синтез гистамина, а, следовательно, снижает аллергический потенциал энтерального питания для организма.
Благодаря нормальной кишечной аутофлоре происходит эндогенный синтез многих витаминов (В1, В2, В5, В6, В, РР, К, С, Н) и незаменимых аминокислот, а также улучшается всасывание витаминов Д и Е, поступивших в организм с пищей.
Микрофлора урогенитальной системы. Почки, мочеточники и моча в мочевом пузыре в норме стерильны. На наружных половых органах мужчин и женщин обнаруживаются микобактерии смегмы (Mycobacterium smegmalis), непатогенные, иногда патогенные стафилококки, диплококки, коринебактерии, микоплазмы, но пейзаж микроорганизмов однообразен, включает 2-3-4 вида. Уретра женщин обычно стерильна. Уретра мужчин имеет немногочисленную микрофлору: непатогенные кокки, сапрофиты, дрожжи. Микрофлора влагалища разнообразна, но непостоянна, зависит от многих причин, в том числе и от функции яичников, от возраста и общей резистентности организма, а также от уровня гликогена в клетках эпителия влагалища и рН влагалищного секрета. Сразу после рождения женщины происходит заселение влагалища лактобактериями, затем появляется кокковая флора. В зрелом возрасте кроме лактобактерий и непатогенных кокков появляются непатогенные стрептококки, клебсиеллы, бактероиды, анаэробы, микоплазмы, дрожжевые грибы, грибы рода Candida. Но основным и важнейшим представителем нормальной микрофлоры влагалища является Вас. vaginalis (палочка Дедерлейна -лактобактерии). В некоторых случаях в микрофлоре влагалища появляются и вызывают заболевания такие микробы, как патогенные или условно-патогенные стафилококки, стрептококки, синегнойные палочки, клебсиеллы, хламидии, а также микробные ассоциации. Хламидии, вызывающие распространённое в настоящее время заболевание хламидиоз, не являются представителем нормальной микрофлоры влагалища.
Поражения органов урогенитального аппарата, вызванные микоплазмами и хламидиями, сложны как в диагностике, так и в лечении. Трудности в диагностике вызваны особенностями строения и культивирования микроорганизмов.
Педиатрические аспекты
Кишечник родившегося ребенка стерилен. Первым и основным источником микробной флоры для новорожденного ребенка является мать. Первичная микробная контаминация ребенка начинается за счет флоры влагалища уже во время родового акта при прохождении родовых путей матери. В дальнейшем в результате постоянного контакта с матерью аутофлора новорожденного начинает формироваться в основном за счет микрофлоры кишечника матери.
Существует мнение, что основа для формирования микробной аутофлоры будущего ребенка закладывается еще во время беременности под влиянием иммунной системы матери. Считают, что в основе этого явления лежит механизм иммунологической толерантности, формирующийся у плода в результате проникновения через плаценту антигенов, характерных для микробного пейзажа матери.
При грудном вскармливании к 4 - 6 - 7 дню появляются бифидобактерии, энтерококки, лактобактерий, но при искусственном вскармливании в кишечнике новорожденных быстро появляются стафилококки, стрептококки, сарцины, анаэробные бактерии, дрожжи, а также возникают изменения в составе нормальной микрофлоры кишечника. Например, бактероиды у детей с искусственным вскармливанием высеваются в большем количестве (1010) и от 5 до 10% диарей вызываются этими микробами. Вейлонеллы у детей, находящихся на искусственном вскармливании, также регистрируются чаще и в большем количестве (108), чем у взрослых (105) и иногда вызывают у них диспептические явления. Среди бифидобактерий у них чаще всего присутствуют виды В. adolescentis и В.longus, что характерно чаще всего для взрослых, а не В.biphidus и В.inphantis, как это бывает при грудном вскармливании.
Следовательно, профилактика нарушений микробиоценоза новорожденного должна начинаться еще задолго до его рождения путем коррекции дисбактериоза родовых путей и кишечника, если таковые имеются у будущей матери.
Цели занятия:
1. Изучить нормальную микрофлору кожи, слизистых, различных полостей организма человека (рта, желудочно-кишечного тракта, мочеполовой системы), функции и механизмы действия микрофлоры на макроорганизм.
2. Изучить причины и условия формирования дисбактериозов, усвоить принципы получения эубиотиков (пробиотиков), показания к их применению.
Учебно-целевые задачи:
Знать:
1. Понятие о нормальной микрофлоре тела человека.
2. Характеристика нормальной микрофлоры кожи, слизистых, различных полостей организма человека.
3. Особенности взаимоотношений между отдельными микроорганизмами в системе микрофлоры организма человека (синергизм, антагонизм и др.).
4. Роль нормальной микрофлоры человека для его здоровья.
5. Факторы, оказывающие влияние на количественный и качественный состав микрофлоры организма человека.
6. Методы исследования нормальной микрофлоры организма человека, критерии оценки.
7. Причины и условия возникновения дисбактериозов.
8. Методы микробиологического изучения дисбактериозов, практическая значимость исследований.
9. Препараты для восстановления нормальной микрофлоры организма человека (эубиотики или пробиотики), принципы их получения, показания к применению.
Уметь:
1. Освоить основные микробиологические методы изучения микрофлоры организма человека;
2. Освоить методику взятия материала для микробиологического исследования со слизистой рото- и носоглотки и зева стерильным ватным тампоном;
3. Проводить оценку качественного и количественного состава микрофлоры кожи, рото- и носоглотки.
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
Для изучения состава микрофлоры организма используют бактериос-копический и бактериологический методы. В частности, для изучения микрофлоры полости рта готовят мазки из зубного налета и окрашивают по Граму и Бурри. Кроме этого, делают посевы на элективные среды для выделения и последующей идентификации чистой культуры бактерий.
Микробиологическое исследование фекалий производится в целях определения состояния нормальной микрофлоры или для исключения дисбактериоза кишечника. Показания для него разнообразны: предоперационное обследование больных, кишечные инфекции неясной этиологии, дисфункции кишечника после антибиотикотерапии, уточнение диагноза и др.
Забор свежих фекалий производят в стерильную взвешенную посуду и доставляют в лабораторию не позднее чем через 2 часа. Исследуемые фекалии помещают в тиогликолиевый буфер (способствующий сохранению как аэробной, так и анаэробной микрофлоры), затем готовят десятикратные разведения надосадочной жидкости в физиологическом растворе и высевают на элективные и дифференциально-диагностические среды, соответственно группам выделяемых микроорганизмов. Схема посева разведений на питательные среды
| Разведение материала | Посевная доза | Среды | Конечное Разведение |
| 10-1 10-3 10-5 10-7 10-9 10-11 (дети до 1 года) | 1,0 0,1 0,1 0,5 0,1 0,1 0,5 0,1 0,1 0,5 1,0 0,1 0,1 1,0 0,1 1,0 0,1 | Селенитовый бульон Плоскирева, Левина Желточно-солевой агар, Сабуро Среда для клостридий (4,5 мл) Кровяной агар, Эндо Среда для лактобактерий (4,5мл) Среда для клостридий (4,5 мл) Кровяной агар, Эндо Анаэробный агар Среда для лактобактерий (4,5мл) Среда для бифидобактерий (9-10 мл) Среда для бифидобактерий (9-10 мл) Анаэробный агар Среда для бифидобактерий (9-10 мл) Среда для бифидобактерий (9-10 мл) Среда для бифидобактерий (9-10 мл) Среда для бифидобактерий (9-10 мл) | ----- 10-2 10-4 10-4 10-6 10-6 10-6 10-8 10-8 10-8 10-8 10-9 10-10 10-10 10-11 10-12 10-13 |
Посевы на факультативные анаэробы инкубируют в обычном термостате при 37°С, на дрожжеподобные грибы при 28-30°С, на бактероиды и лактобактерии в анаэростате при 37°С. Из выросших подозрительных колоний выделяют чистые культуры микроорганизмов, в целях их идентификации проводят изучение культуральных, морфологических, биохимических, патогенных и др. свойств. Идентификацию проводят как для выделенных патогенных и условно-патогенных возбудителей, так и для представителей нормальной микрофлоры кишечника.
Количество обнаруженных микроорганизмов выражают в десятичных логарифмах, учитывая посевную дозу и разведения, из которых сделан высев.
Для восстановления микроэкологического статуса больных с явлениями дисбиоза применяются биологические бактерийные препараты (пробиотики или эубиотики), приготовленные из штаммов живых бактерий аутохтонной флоры и/или продуктов их жизнедеятельности. Монокомпонентные сухие препараты бифидумбактерин, лактобактерин, колибактерин готовятся из одноименных бактерий, бактисубтил – из Bacillus cereus, бактиспорин - из B. subtillis. Поликомпонентные: бифилонг содержит два вида бифидумбактерий (B. bifidum, B.longum), ацилакт - три штамма лактобактерий, аципол – L. acidophilus и полисахарид кефирных грибков, линекс- В. acidophilus, В. infantis, Enterococcus faecalis, биоспорин - В. subtillis, В.lichiniformis, бификол - бифидобактерий и кишечная палочка, бифилакт- бифидобактерий и лактобактерий. Кроме лиофилизированных препаратов из бифидо- и лактобактерий в последние годы стали производить жидкие (закваски), а на их основе - лечебно-профилактические кисломолочные продукты. Считают, что эффективность таких препаратов выше по сравнению с сухими, поскольку они содержат уже готовые биологически активные вещества и сами бактерии в них более активны.
ДЕМОНСТРАЦИИ
1. Таблицы с перечнем облигатной и факультативной микрофлоры полости рта и кишечника.
2. Рисунки микрофлоры зубного налета (окраска по Граму и Бурри).
3. Рост бифидумбактерий на среде Блаурокка.
4. Препараты, применяемые для коррекции нормальной микрофлоры человека при дисбактериозах (сухие и жидкие эубиотики, кисломолочный бифидумбактерин и др.)
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА
1. Каждый студент готовит препарат из зубного налета. В бригаде из двух человек один окрашивает препарат по Граму, второй - по методу Бурри.
2. Каждый студент готовит препарат из чистой культуры бифидумбактерий, окрашивает по Граму и микроскопирует.
3. Бригада студентов из 3 -4 человек производит посев «отпечатков» пальцев на пластинчатый агар в соответствующем секторе чашки Петри.
4. Бригада студентов из 3 - 4 человек производит посев материала из зева и носа на МПА и ЖСА в чашки Петри.
5. Студенты учитывают результаты посева воздуха по Коху и с помощью аппарата Кротова делают заключение о загрязненности исследованного воздуха.
6. Студенты учитывают результаты посева смывов с рук на среду Кесслера и делают заключение о возможном загрязнении рук.
7. Студенты учитывают результат по определению микробного числа воды.
8. Студенты засевают Pr. vulgaris на обычный и карболовый агар.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
1. Какие микроорганизмы встречаются на коже, конъюнктиве?
2. Какие микроорганизмы выявляются в верхних дыхательных путях?
3. Перечислите шаровидных и извитых бактерий, встречающихся в полости рта?
4. Перечислите палочковидных микробов, встречающихся в полости рта.
5. Какие микроорганизмы встречаются в толстом кишечнике?
6. Какие микроорганизмы встречаются в тонком кишечнике?
7. Какую роль играют микроорганизмы толстого кишечника в физиологии человека?
8. Какие микроорганизмы из числа нормальной микрофлоры человека являются облигатными анаэробами?
9. Какие микроорганизмы из числа постоянных обитателей полости рта принимают участие в развитии кариеса, парадонтита и гингивита?
10. Какие причины могут приводить к возникновению дисбактериоза?
11. Какие микроорганизмы могут преобладать в случае развития дисбактериоза?
12. К каким последствиям может приводить дисфункциянормальной микрофлоры?
13. Какие вопросы изучает гнотобиология?
14. Какую функцию выполняет биопленка кишечника?
15. Какими методами изучается нормальная микрофлора человеческого организма?
16. В каких случаях проводится обследование на дисбактериоз?
17. Какой материал берется для исследования при дисбактериозе кишечника?
18. Как проводится микробиологическое обследование при дисбактериозе?
19. Какие питательные среды применяются при обследовании на дисбактериоз?
20. Какие биопрепараты применяются для восстановления нормальной микрофлоры?
21. Каков принцип получения эубиотиков и пробиотиков?
22. Как получаются жидкие эубиотики, в чем их преимущество перед сухими?
23. Как получают кисло - молочный бифидумбактерин и лактобактерин, в каких случаях их следует применять?
24. Какие факторы влияют на количественный и качественный состав нормальной микрофлоры тела человека?
25. Какие взаимоотношения существуют между отдельными микроорганизмами в системе микрофлоры организма человека?
26. Какая взаимосвязь существует между нормальной микрофлорой организма человека и функционированием его иммунной системы?
ЗАНЯТИЕ №10
Тема:
• Генетика микроорганизмов.
План занятия:
1. Организация генетического аппарата у бактерий и вирусов. Генотип и фенотип.
2. Рекомбинации у бактерий: трансформация,трансдукция, конъюгация.
3. Модификации у бактерий и вирусов.
4. Мутации у бактерий и вирусов. Диссоциации.
5. Идентификация нуклеиновых кислот. Полимеразная цепная реакция (ПЦР), молекулярная гибридизация.
6. Генная инженерия.
ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ
Исследования в области генетики микроорганизмов ознаменовались выдающимися открытиями. Установлены генетическая роль дезоксири-бонуклеиновой кислоты, структура гена, расшифрован генетический код, выявлены многие закономерности процессов мутагенеза, создано новое направление в изучении генетики - генная инженерия, с помощью которой можно производить пересадку генов из одной клетки в другую, что позволяет управлять наследственностью микроорганизмов.
У бактерий имеется одна замкнутая кольцевая хромосома, содержащая до 4000 отдельных генов, необходимых для поддержания жизнедеятельности и размножения бактерий, т. е. бактериальная клетка гаплоидна, а удвоение хромосомы всегда сопровождается ее делением. Обычная бактериальная хромосома имеет молекулярную массу около 1010 Д (5х106 пар оснований; размер генома человека составляет 2,9х109 пар оснований). Длина бактериальной хромосомы в развернутом состоянии, впервые установленная методом радиоавтографии, для клеток Е.coli составляет около 1 мм.
В некоторых бактериях обнаруживают внехромосомные молекулы ДНК, представленные плазмидами. Они не являются жизненно необходимыми, т. е. не кодируют информацию о синтезе ферментов, участвующих в энергетическом и пластическом метаболизме. Плазмиды физически либо не связаны с хромосомой (автономное состояние), либо встроены в бактериальную хромосому (интегрированное состояние). В автономном состоянии они самостоятельно реплицируются.Плазмиды - фрагменты ДНК с молекулярной массой 106 -108 Д, несущие от 40 до 50 генов, несут 2 функции:регуляторную и кодирующую. Первая состоит в компенсации нарушений метаболизма ДНК клетки хозяина. Например, при интегрировании плазмиды в состав поврежденного бактериального генома, неспособного к репликации, его функция восстанавливается за счет плазмидного репликона. Кодирующая функция плазмид состоит во внесении в бактериальную клетку новой информации, о которой судят по приобретенному признаку, например, образованию пилей (Р-плазмиды), резистентности к а/6 (R-плазмиды), выделению бактериоцинов (соl-плазмида).
Конъюгативные плазмиды - переносятся от бактерии к бактерии (обычно внутри вида или близкородственными видами) в процессе конъюгации, обычно это относительно крупные Р-, Р-, Со1-плазмиды (чаще выявляются у Гр- палочек).
Неконъюгативные плазмиды обычно характерны для Гр+ кокков, но могут встречаться и у Гр - микроорганизмов; небольшие по размерам могут присутствовать до 30 на 1 клетку. Неконъюгативные плазмиды тоже могут быть перенесены из клетки в клетку при наличии у бактерии одновременно конъюгативных и неконъюгативных плазмид.
R-плазмиды обуславливают устойчивость к лекарственным препаратам, например к сульфаниламидам, стрептомицину, пенициллину тетрациклину либо устойчивость к тяжелым металлам (ртуть, никель, кадмий, кобальт). R-плазмиды выявляют постановкой чувствительности бактерий к антибиотикам методом диффузии в агар из бумажных дисков.
F-плазмиды удвоение ДНК некоторых плазмид индуцирует деление бактерий, т. е. увеличивает их «плодовитость». Интегрированные в бактериальную хромосому F-плазмиды называют Нfr - плазмиды (от англ. High frequency of recombiyions - высокая частота рекомбинации). F-плазмида контролирует синтез половых ворсинок (sex илиF pili), которые способствуют эффективному спариванию бактерий-доноров с реципиентными клетками при конъюгации.
Соl-плазмиды контролируют синтез особого рода антибактериальных веществ белковой природы -бактериоцинов, способных вызывать гибель бактерий того же вида или близких видов. Бактериоцины обнаружены у кишечной палочки (колицины), бактерий чумы (пестицины), холерных вибрионов (вибриоцины), стафилококков (стафилоцины). Известно более 200 различных бактериоцинов.
Роль этих продуктов связана с формированием микробных сообществ (напрмер, в кишечнике человека бактериоцины Е. соli вызывают гибель патогенных энтеробактерий). Бактериоциногения более выражена у Гр-микроорганизмов, но распространена и у Гр + бактерий.
Способность к синтезу бактериоцинов используют в эпидемиологических исследованиях, выявляя тип колицина, вырабатываемого патогенным видом (колицинотипирование),либо тип плазмиды (колициногенотипирование).
Плазмиды патогенности контролируют вирулентные свойства многих видов, особенно энтеробактерий. В частности F-, R-, Со1- плазмиды в интегрированном состоянии включают tox+ транспозоны, кодирующие токсинообразование. Нередко tox+ транспозоны кодируют синтез интактных протоксинов (например, дифтерийного или ботулинического), активируемых клеточными протеазами, образование которых контролируют гены бактериальных хромосом.
Фенотипические изменения какого-либо признака или нескольких признаков называют модификациями, они не находятся под контролем генома, не сопровождаются изменениями первичной структуры ДНК и вскоре, после действия фактора и его прекращения, утрачиваются. Модификации проявляются в мире бактерий довольно часто, они могут возникать в популяции любого вида.
У бактерий чаще наблюдаются морфологические модификации, приводящие к обратимым изменениям формы бактерий. Так, например, в старых культурах палочковидные бактерии изменяются до кокковидных, подвижные бактерии теряют подвижность на средах с формалином, пигментообразующие бактерии временно утрачивают синтез пигмента . Биохимические модификации: основу составляют индуцибельный синтез ферментов, заключающийся в индукции и репрессии соответствующих структурных генов, контролируемых регуляторными генами. Так, например, кишечная палочка только в присутствии лактозы синтезирует ферменты, необходимые для ее ферментации. Стафилококки только в присутствии пенициллина синтезируют фермент, разрушающий данный антибиотик.
К модификациям относят включение «молчащих» генов (без их перестройки) некоторых микроорганизмов, в результате чего происходит смена их антигенов в ходе инфекционного заболевания.
Модификации могут возникать под непосредственным действием а/б, например пенициллина. Образующиеся при этом L-формы бактерий, лишенные клеточной стенки, могут сохраняться и даже размножаться внутри клеток хозяина и вновь реверсировать к исходной форме после прекращения действия пенициллина (бледная трепонема, микобактерии туберкулеза, гонококки).
Модификации возникают как адаптивные реакции бактериальных клеток на изменение окружающей среды, что позволяет им быстро приспосабливаться и сохранять численность популяции на жизнеспособном уровне.
Своеобразной формой изменчивости являетсяR-S диссоциация бактерий. Она возникает спонтанно вследствие образования двух форм бактериальных клеток, которые отличаются друг от друга по характеру образуемых ими колоний на твердой питательной среде. Один тип – R - колонии (rough - неровный) - характеризуется неровными краями и шероховатой поверхностью; второй тип - S-колонии (smooth- гладкий) - имеет круглую форму гладкую поверхность. Процесс диссоциации, т. е. расщепления бактериальных клеток, формирующих оба типа колоний, обычно протекает в одном направлении: от S- к R - форме, иногда через промежуточные стадии образования слизистых (М) или карликовых (Д) колоний. Обратный переход R- в S - форму наблюдается реже. Для большинства вирулентных бактерий характерен рост в виде S - формы колоний. Исключение составляют микобактерии туберкулеза, иерсинии чумы, сибиреязвенные бактерии и некоторые другие, которые в R - форме являются вирулентными.
В процессе диссоциации одновременно с изменением морфологии колоний меняются биохимические, антигенные, патогенные свойства бактерий, их устойчивость к физическим и химическим факторам внешней среды.
Мутации, которые приводят к S – R -диссоциации, относятся к инсерта-ционным, поскольку они возникают после встраивания внехромосомных факторов наследственности - умеренных фагов, либо неконъюгативных крупных плазмид, которые кодируют образование детерминантных полисахаридных звеньев липополисахарида у Гр - бактерий (имеющих значение для инвазивности у шигелл Зонне и пенетрации шигелл Флекснера в эпителиальные клетки кишечника). Утеря этих плазмид приводит к образованию R -мутантов. Они формируют шероховатые колонии, изменяют свои антигенные свойства и резко ослабляют патогенность. У дифтерийных бактерий S-R-диссоциэция связана с их лизогенизацией бактериофагами. При этом R -формы образуют токсин. У других бактерий R-формы возникают после интеграции в их хромосому R-плазмиды, транспозонов или Is-последовательностей. R-формы пиогенных стрептококков и ряда других бактерий образуются в результате рекомбинаций.
Биологическое значение S-R-диссоциации состоит в приобретении бактериями определенных селективных преимуществ, обеспечивающих их существование в организме человека или во внешней среде. К ним относится более высокая устойчивость S-форм к фагоцитозу макрофагами, бактерицидному действию сыворотки крови. R-формы обладают большей устойчивостью к факторам окружающей среды. Они более длительное время сохраняются в воде, молоке. S-R-диссоциация усложняет бактериологическую диагностику ряда инфекционных заболеваний, например дизентерии Зонне, эшерихиоза, вызванного Е.соli 0124 и др.
Мутации и индукция новых мутаций мутагенами представляют собой ценный инструмент в генетических и биохимических исследованиях.
Во-первых, изменения, которые вызывает мутация в определенном гене, позволяют не только его идентифицировать, но и точно указать его место в хромосоме с помощью методов генетического картирования. Во-вторых, анализ мутантных штаммов, у которых нарушены различные этапы сложной цепи биохимических процессов, может вскрыть детали организации генетического и биохимического аппаратов. В-третьих, знание механизмов действия различных мутагенов может помочь в установлении корреляции между мутагенным и канцерогенным действием множества факторов окружающей среды (химические агенты, радиоактивное излучение и др.).
Прокариотам не свойственно половое размножение. Рекомбинации у них осуществляются в результате проникновения в клетку реципиента не всей хромосомы донора, а только её части, определенного фрагмента, что приводит к формированию мерозиготы и образованию одного рекомбинанта. Генотип такого рекомбинанта представлен в основном генотипом реципиента с включенным в него фрагментом донорской ДНК. Передача генетического материала от одних бактерий другим может осуществляться путём передачи чистой ДНК, что может быть осуществлено в экспериментальных условиях (трансформация), либо фрагмент донорской ДНК переносится клетке-реципиенту с генетическим материалом умеренного фага (трансдукция), либо фрагменты ДНК донора передаются клетке реципиенту при непосредственном контакте клеток с участием половых ворсинок (конъюгация).
Способы генетического обмена, наряду с процессами мутирования генов, играют важную роль и обусловливают генетическую изменчивость, поставляющую материал для эволюции. Эти процессы также важны и для понимания биохимических и генетических механизмов функционирования бактерий, установления принципов строения и регуляции генов, а также расшифровки сложных процессов синтеза макромолекул, роста и деления клеток.
Современная генетика интенсивно изучает молекулярно - генетические основы патогенности и иммуногенности микроорганизмов, механизмов образования новых биологических вариантов патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, распространением антибиотикорезистентных штаммов на фоне расширяющегося арсенала химиотерапевтических средств. Большое внимание уделяется получению микроорганизмов со сниженной вирулентностью и сохраненной иммуногенностью - вакцинных штаммов.
Название «вакцина» было дано Луи Пастером всем прививочным препаратам, полученным из микроорагнизмов и их продуктов. Э. Дженнером была получена первая живая вакцина, содержащая вирус коровьей оспы (vaccinus - коровий), идентичный по антигенным свойствам вирусу натуральной оспы человека, но маловирулентной человеку, т. е. данная вакцина была заимствована из природы. В России применяется другая вакцина, заимствованная у природы - сибиреязвенная вакцина СТИ, названная в честь сотрудников санитарно-технологического института г. Ленинграда, выделивших из почвы бескапсульный вариант сибирской язвы. Заслугой Луи Пастера была разработка принципов направленного получения аттенуированных вакцинных штаммов - селекция спонтанных мутантов с пониженной вирулентностью и сохраненными иммуногенными свойствами путем культивирования их в определенных условиях, пассирования через организм устойчивых к данной инфекции животных, через куриный эмбрион, через культуру клеток, после длительного действия бактериофага, воздействия ультрафиолетовых, рентгеновских лучей.
Антирабическая вакцина получена Л. Пастером в результате 133 пассажей уличного вируса бешенства через мозг кроликов.
Чумная вакцина ЕУ получена Г. Жераром и Ж. Робиком при культивировании чумных бактерий при температуре 16°С в течение 5 лет.
Вакцина БЦЖ получена А. Кальметтом и Ш. Гереном при длительном культивировании микобактерий туберкулеза бычьего типа на глицериновом картофеле с желчью. Желчь явилась фактором, неблагоприятным для микобактерий, что привело к ослаблению вирулентности этого штамма.
Бруцеллезная, туляремийная вакцины были получены при культивировании на картофельной среде в течение 5 лет.
Вакцина против вируса желтой лихорадки была получена238 пассажами на белых мышах.
Вакцины против гриппа, кори, краснухи, полиомиелита также получены под воздействием различных факторов- азотистой кислоты, гидроксиламина, бромзамещенных оснований, повышения температуры, понижения рН среды, ультразвука, ультрафиолетовых лучей, нуклеазы и др.
Современная биотехнология приготовления вакцин включает ряд этапов: накопление значительных количеств микробной массы или токсина на специальных питательных средах при оптимальных температурных и других условиях при постоянной аэрации, а для анаэробов - при отсутствии кислорода. Большинство вакцин высушивают из замороженного состояния в глубоком вакууме (лиофильная сушка). Это обеспечивает их длительное хранение.
Достижение генной инженерии: получена рекомбинантная гриппозная вакцина, вакцина против гепатита В. Благодаря переносам генов человека, кодирующих синтез инсулина, интерферона в геном Е.соli, налажено производство генно-инженерного инсулина, интерферона.
Цели занятия:
1. Ознакомиться с особенностями генома бактериальной клетки, его отличием от генома эукариотической клетки; видами и формами изменчивости микроорганизмов; основными механизмами изменчивости микроорганизмов.
2. Изучить методы генетической диагностики инфекционных заболеваний. Ознакомиться с практическим применением достижений генной инженерии.
Учебно-целевые задачи:
Знать:
1. Особенности генома бактериальной клетки.
2. Отличия генома бактериальной клетки от генома эукариотов и вирусов.
3. Внехромосомные детерминанты наследственности - плазмиды,их функции.
4. Механизмы передачи генетического материала у бактерий (конъюгация, трансформация, трансдукция).
5. Достижения генной инженерии в получении новых лекарственных препаратов.
6. Механизмы, обусловливающие изменчивость микроорганизмов(адаптации, мутации, рекомбинации).
7. Методы генетической диагностики инфекционных заболеваний (ПЦР, молеклярная гибридизация).
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ